venerdì 3 maggio 2013

Selezione articoli Genetica Clinica/Umana Aprile 2013. R. Tenconi



Scelta di articoli di Genetica Clinica/Umana pubblicati in Aprile 2013 nelle seguenti riviste: Lancet, Lancet Neurology, Nature, Nature Neuroscience, Nature Biotechnology, Nature Genetics, Nature Medicine, Nature Reviews Genetics, Nature Reviews Neuroscience, NEJM, PNAS, Science & Cell.

MALATTIE NEUROLOGICHE/NEURODEGENERATIVE/PSICHIATRICHE
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The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nature Reviews Neuroscience 2013;  248 advance online publication. La ALS è stata oggetto di recenti ricerche (alcune segnalate in numerosi articoli, in particolare del Marzo 2013, o spigolature) per capire se si tratti di una proteinopatia o di una ribonucleopatia o di ambedue (come sembra proprio). E poi i rapporti patogenetici della ASL con altre malattie neurodegenerative come la Demenza frontotemporale (FTD) e altre come le atrofie cerebellari la distrofia miotonica e la miosite da corpi inclusi. La Review fa il punto della situazione attuale su questa grave e rapidamente ingravescente (3-5 anni) malattia neurodegenerativa che ha una frequenza di 1-2:100,000 ma può manifestarsi a ogni età. Può essere sporadica, se familiare (10% dei casi) molto più frequentemente AD, ma anche AR e XL. Il 15% dei pz ALS ha FTD con inclusioni TDP-43 nei neuroni corticali, mentre almeno il 50% hanno una certa disfunzione cognitiva o disturbi comportamentali, e il 15% di pz con FTD hanno ALS con coinvolgimento dei motoneuroni inferiori(sono gli estremi di uno spettro fenotipico). Sono noti quasi 30 geni, 25 geni, alcuni possibili e almeno 3 solo i loci, quelli più frequenti sono SOD (20%) e l’espansione esanucleotidica in una regione non codificante del gene C9ORF72 (40-50% dei casi), con espressione clinica molto variabile anche per mutazioni dello stesso gene, il che fa pensare alla presenza di geni modificatori. Rimangono aperte alcune questioni: quando inizia dal punto di vista patologico, perché in genere si manifesta sui 50-60 anni e perché porta a morte in pochi anni? Il fatto che sia una proteino-e una ribonucleo-patia potrebbe favorire un miglior intervento terapeutico.

Unconventional Translation of C9ORF72 GGGGCC Expansion Generates Insoluble Polypeptides Specific to c9FTD/ALS. Neuron 2013;77:639. Nuovo articolo sulla patogenesi della Sclerosi Laterale Amiotrofica e Demenza Frontotemporale che potrebbe avere implicazioni diagnostiche e terapeutiche. La struttura di RNA di ripetizioni GGGGCC rende il trascritto suscettibile di un meccanismo non convenzionale di traduzione, chiamato Repeat Associated Non-ATG Translation  (RAN-translation), che consente la traduzione di segmenti di DNA che non sono geni senza un codone di inizio e nelle due direzioni. L’uso di anticorpi anti proteine GGGGCC con RAN-translation (anti-C9RANT) mostra l’accumulo di materiale insolubile e di alto peso molecolare a livello cerebrale e nelle inclusioni neuronali di pz con c9FTD/ALS. Questa immunoreattività non è stata trovata nei tessuti periferici né in altre malattie neurodegenerative, comprese quelle da ripetizioni CAG. Potrebbe essere un marcatore biologico per questa comune causa di FTD/ALS.

Molecular chaperone Hsp110 rescues a vesicle transport defect produced by an ALS-associated
mutant SOD1 protein in squid axoplasm. Pnas 2013;110:5428. Nella ALS vi è accumulo in grossi aggregati citosolici dei motoneuroni delle proteine mutate, come SOD1, TARDB, FUS, optineurina (OPTN) e Ubiquilina 2 (UBQLN2). E’ più agevole studiare SOD1 perché c’è un bel modello di topo transgenico con eccesso di produzione delle varie mutazioni di questo enzima, che destabilizzano la proteina causandone nel topo il malripiegamento e l’aggregazione e provocando, dopo qualche mese, i segni della malattia molto simili a quella nell’uomo. Non si sa bene come questi segni si producano, si sa che il danno del motoneurone comporta anomalie elettrofisiologiche, difetti mitocondriali, di trasporto assonale, disfunzione della giunzione/retrazione  neuronale, con un contributo anche della glia che svolge un importante ruolo nella progressione (vedi precedenti Spigolature). Quesiti a cui rispondere: quali e come mutanti SOD1 sono tossichi, vi sono chaperoni molecolari, che legano proteine non native  e ne consentono il normale ripiegamento per prevenirne l’azione tossica?  In questo lavoro ci provano ricorrendo a un modello ben stabilito di trasporto assonale veloce usando axoplasmi dall’assone gigante di un calamaro. Nel lavoro si dimostra che l’aggiunta di una proteina mutante di SOD1 e di una molecola chaperone Hsp110, in rapporto stechiometrico con il mutante, ristabilisce il difetto di trasporto assonale. Un possibile ruolo quindi per i chaperoni molecolari nel legare le proteine anomale SOD1 e prevenirne la tossicità.

Hsp70 nucleotide exchange factor Fes1 is essential for ubiquitin-dependent degradation of misfolded cytosolic proteins. PNAS 2013;110:5975. C’è, come precisato anche sopra, un controllo di qualità delle proteine per evitare il loro accumulo e promuovere la loro degradazione. Quando questo meccanismo si inceppa produce patologia, come ad esempio quella che porta alla neurodegenerazione. Il ripiegamento proteico è favorito dalla associazione delle molecole chaperone della proteina heat shock 70 (Hsp 70)(che facilita la sintesi proteica, il ripiegamento, il trasporto e la degradazione e aiuta le cellule a proteggersi da fattori di stress come il calore). Se questo non avviene  Hsp 70 ne favorisce la degradazione, con un meccanismo non noto. In questo lavoro si propone un modello di interazione con Hsp da parte di un fattore di scambio nucleotidico, Fes1, facilita la perdita delle proteine malripiegate dal compleso Hsp 70 promuovendo la loro distruzione  dal sistema ubiquitina-proteasoma (vedi autorizzazione europea del brevetto del farmaco Orphazyme per la terapia con proteina heat shock 70 (Hsp70) delle malattie lisosomiali (Editors’ pick. Nature Biotechnology 2013;31:189. L’Europa ha approvato il brevetto la terapia con proteina)(Spigolature Marzo 2013).

Deciphering mutant ELOVL4 activity in autosomal-dominant Stargardt macular dystrophy. PNAS 2013;110:5446.  La malattia Stargardt tipo 3 (STGD3)(MIM #600110)(c’è una STGD1) è frequente e caratterizzata da degenerazione maculare a inizio dai 7 ai 12 anni con un decorso rapidamente progressive e scarsissima visione finale, ma con campo visivo normale. Il gene malattia è ELOVL4 (Elongation of very long chain fatty acids 4) il cui prodotto è una elongasi necessaria per la biosintesi di acidi grassi polinsaturi a lunga catena (VLC-PUFA)(vedi anche selezione articoli Marzo 2013: Role of ELOVL4 and very long-chain polyunsaturated fatty acids in mouse models of Stargardt type 3 retinal degeneration. PNAS 2103;110:5181).
La proteina normale di questo gene si localizza nel reticolo endoplasmatico, mentre quella tronca mutata si localizza in altri organelli. L’ipotesi del lavoro è che generi intermedi della biosintesi degli acidi grassi che hanno un’azione tossica. In vitro si dimostra che la proteina mutate perde la sua attività di condensazione che è la prima tappa del ciclo metabolico della biosintesi VLC e svolge un ruolo dominante negativo sulla localizzazione e sull’attività enzimatica (in accordo con le conclusioni dell’articolo citato nel Marzo 2013). Si conclude quindi che la riduzione di sintesi VLC-PUFA contribuisce alla patologia retinica. Come prospettive terapeutiche potrebbe essere l’assunzione di VLC-PUFA con la dieta o interventi diretti a aumentarne i livelli direttamente nella retina.

Identification of risk loci with shared effects on five major psychiatric disorders: a genome-wide analysis. Lancet 2013;381:1371. La classificazione delle malattie psichiatriche risale alla fine del 19° secolo con la distinzione tra demenza precoce (schizofrenia) e insanità maniaco depressiva. E poi decenni dopo disordine bipolare  e depressione unipolare (maggiore). La classificazione quindi è su base clinico-evolutiva con ampi margini di sovrapposizione tra le arie condizioni. La patognesi è in gran parte ignota. L’imminente revisione del Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM) e del International Classification of Diseases (ICD) sta portando a una nuova classificazione anche usando le conoscenze genetiche dato che per queste patologie comportamentali c’è un’importante component ereditaria. E’ stato costituito un consorzio internazionale, Psychiatric Genomics Consortium nel 2007 che ha voluto verificare la base biologiche dello spettro autistico, ADHD, disordine bipolare, depressione maggiore e schizofrenia mediante analisi GWAS (SNP). Indagine effettuata da per un totale di 33.332 casi e 27.888 controlli di origine europea (19 paesi). Quesiti: 1. identificare SNP in associazione a queste patologie, se vi sono loci a rischio in comune meglio, per aumentare il potere statistico, metterli insieme piuttosto di suddividerli per categoria clinica; 2.
L’effetto di varianti note per una specifica malattia sul campione comune. Scopi: valutare la possibilità di una classificazione delle malattie psichiatriche su base biologica e non più su base clinico-evolutiva, identificare potenziali meccanismi patogenetici che predispongono a specifici quadri clinici e proporre modelli preventivi e terapeutici (mica male come finalità, forse troppo ambiziose, ndr). Trovati significativi quattro loci-regioni (in 3p e in 10q) e 2 in geni del canale del calcio (CACNA1C e CACNB2).
Vedi anche Shared genetics among major psychiatric disorders (stesso fascicolo, pg 1339) con una bellissima figura riassuntiva delle conoscenze attuali della patogenesi delle principali malattie psichiatriche (perfetta per lezioni).

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Ancora sul DSM: On the spectrum. Nature 2013;496:416. La ricerca suggerisce che le malattie mentali si posizione lungo uno spettro clinico, ma l’ultimo manuale diagnostico (DSM-5) della Associazione Americana Psichiatria (APA), che verrà presentato al prossimo 18 Maggio nel corso del congresso APA a San Francisco, ne fa condizioni distinte, basandosi su vecchie categorie e su sintomi soggettivi (nella Selezione delle Spigolature dell’Aprile 2013 ci sono ampie e feroci critiche di questo nuovo manuale). Viene fatta la storia di queste DSM dal 1952 a oggi (la Chiesa Cattolica romana, dice il commentatore, ha cambiato più spesso Papa di quanto APA ha pubblicato un nuovo DSM). Ma le mura di cemento che dividono una condizione dall’altra stanno crollando nella pratica clinica dove un quinto dei pz che hanno i criteri clinici per una diagnosi ne hanno anche per almeno altre due (questi sono i pz “che non hanno letto il libro” ironizza un commentatore). Ma la ricerca di base, nonostante fondi, ricerche e l’applicazione delle nuove tecniche (neuroimaging, NGS ecc.), non ha chiarito un bel nulla (vedi infatti le varie pubblicazioni citate negli articoli di interesse e nelle Spigolature Aprile 2013 –ferocissime critiche-  e dei mesi scorsi, ndr), ricerca che deve rivedere tutti i risultati ribaltando completamente le diagnosi cliniche su cui si è basata. Ci sono molti pareri ma c’è un accordo su un’idea mediata dalla genetica oncologica con l’applicazione delle nuove tecniche genetiche: la classificazione di un tumore non è più basata sull’organo in cui si forma ma la diagnosi e soprattutto la terapia si basa sul profilo genetico, e, in psichiatria, anche sulle neuroimmagini.
Molto bello anche perché molto ironico (e forse veritiero, ndr) il finale del commento di uno psichiatra interpellato (Neuropsychiatric Genetics and Genomics, Cardiff  University, UK): “I hope I’ll be able to give a patient with possible bipolar a proper clinical assessment.  I’ll do a blood test and look for genetic risks and send them into a brain scanner and ask them (pz) to think of something mildly unhappy to exercise their emotional system. The results could be used to trace the underlying cause — such as a problematic chemical signal in the brain. I’ll then be able to provide lifestyle advice and treatment”. Sì ma, aggiunge dopo una pausa: “Actually it won’t be me, because I will have retired by then” (quest’ultima considerazione teniamocela per noi, ndr).

A very sad story. Nature 2013;497:36. A proposito della “new psychiatrists’ Bible” (DSM-5) in pubblicazione nel Maggio 2013 uno psicoterapeuta ha scritto un libro  (The Book of Woe: The DSM and the Unmaking of Psychiatry.  Blue Rider: 2013. 426 pp. $28.95) che commenta così il nuovo manuale: “Each such manual, DSM or others, has tried to improve on its predecessor. All have failed, says psychotherapist Gary Green­berg in his entertaining, biting and essential The Book of Woe (a braccio: il libro della calamità). But none has failed so spectacularly as the DSM-5” con cognizione di causa perchè l’ha visto e è stato anche invitato a provare l’applicazione di un test presentato in bozza e l’ha trovato inapplicabile per “ inadequacy, the pointless­ness, the sheer (assoluta) idiocy of the exercise”. Porta l’esempio della eliminazione dalla lista della m. Asperger, inserendola nello spettro autistico, ma si stima che da un terzo a tre quarti di pz con s. Aspenger non sono inquadrabili in questa diagnosi con il rischio di perdere la copertura assicurativa e altri benefici. Che faranno gli psichiatri, costretti a applicare il nuovo DSM-5?

GENETICA MEDICA (sequenziamento esonico-genomico, proteoma e CNV)
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Disease-targeted sequencing: a cornerstone in the clinic. Nature Review Genetics 2013;14:295. Sinora i test genetici venivano effettuati su indicazione clinica e il successo diagnostico dipendeva dalla scarsa eterogenità di locus, per patologie a alta eterogeneità la possibilità di arrivare alla conferma molecolare era (direi è, ndr) remota (retinite pigmentosa, l’esempio che fa le review). E il sequenziamento Sanger è stata la tecnica usata per oltre 30 anni. Ora le cose sono cambiate, come sappiamo. Quindi le difficoltà ora non sono le dimensioni del segmento di DNA da analizzare ma la velocità con cui si conoscono i geni malattia. La maggiore applicazioni delle nuove tecniche in clinica è quella del sequenziamento di geni targeted (quelli che consideriamo coinvolti nella patologia causalmente eterogenea che abbiamo in mente, ndr).
Moving to multi-gene tests è la prima tappa logica in clinica, dall’analisi del singolo gene o di pochi geni all’analisi di un gran numero di geni numero con la tecnologia NGS, continuando a studiare, per ricerca, i risultati dell’analisi più approfondita delle variazioni uniche o rare. Considerando (saggiamente, ndr) che il Sanger è economicamente più conveniente del NGS per l’analisi di pochi geni, ma i laboratori si stanno tutti attrezzando per NGS e i costi di questa tecnica riducendo.
Current tests. Bella la Tab. dei test targeted per alcune patologie con il numero di geni da analizzare per ognuna (es. Rasopatie 10, retinite pigmentosa 66-140). Integration into care: finora il clinico (oltre all’obiettività, ndr) ricorreva raramente al test genetico preferendo basare la diagnosi e la cura sugli esami medici (biochmica, imaging), a meno che non fossero dirimenti o fosse richiesta la ricorrenza e la pianificazione familiare. Ma, e fa un esempio significativo, la diagnosi molecolare può cambiare radicalmente la terapia (deficit di alfa-galattosidasi in un caso di miocardiopatia ipertrofica, curabile). Targeted versus genomic approaches. Partiamo dai costi: sequenziamento targeted (molti geni) US$ 2.000–$10.000, analisi a scopi clinici esonica o dell’intero genoma $5.000–$15.000. Argomenti a sfavore dell’approccio diagnostico genomico rispetto al targeted: copertura minore, problemi dell’approccio come falsi negativi (vedi Mutations causing medullary cystic kidney disease type 1 lie in a large VNTR in MUC1 missed by massively parallel sequencing. Nature Genetics 2013;45:299)(Articoli Marzo 2013), varianti di significato incerto (punto estremamente importante, ndr), competenze rilevanti di interpretazione (bioinformatica, ndr), necessità di fenotipo dettagliato (molti articoli considerano quest’ultimo punto secondario, ma non lo è affatto per mettere insieme genetica e clinica, ndr), comunicazione dei risultati ai pz/famiglia (chi trae la conclusione della rilevanza per il fenotipo di uno o più risultati? Il laboratorio proprio no, ndr). Ultimo: NGS ha migliorato il rapporto costi/benefici e la vita dei nostri pz?
E cosa succederà nel prossimo futuro? (Argomento, che meriterebbe un convegno dedicato, ndr).

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The human gene connectome as a map of short cuts for morbid allele discovery. PNAS 2013;110:5558. Come sappiamo dall’analisi con NGS per identificare il gene responsabile di una malattia in una persona otteniamo migliaia di varianti di geni codificanti proteine, ma solo un limitato numero di questi, idealmente uno, è quello causale. Può essere quindi difficile se non impossibile identificare il gene malattia anche perché spesso non conosciamo il modo di trasmissione del carattere in quella famiglia e per gli alti livelli di eterogeneità genetica nella popolazione. Ma sappiamo anche che per una certa malattia, ben definita clinicamente, ci può essere un pathway comune coinvolto in pazienti diversi, quindi ci aspettiamo accanto alla eterogeneità genetica una omogeneità patogenetica. I programmi in uso oggi, come String, FunCoup e HumanNet ci informano del possibile rapporto diretto tra due determinati geni dello stesso pathway, ma non ci aiutano a individuare il pathway di due geni di interesse. Questi programmi sono più adatti quindi per studi di caratteri poligenici che per caratteri monogenici dove c’è un gene-malattia, e tante varianti di minor interesse. L’ipotesi di lavoro è che i geni malattia di una specifica condizione in pazienti differenti facciano parte di un gruppo di geni-chiave o partecipino allo  pathway.
E’ stato quindi messo a punto un metodo “Hypothesis-driven” di analisi dei dati NGS in cui il connettoma umano (HGC) consente la selezione dei geni candidati parte di un dato pathway patologico. La prova pratica dell’utilità di HGC nell’identificare geni malattia è avvenuta con gli errori congeniti dell’immunità TLR3 causa della Encefalite erpetica da virus herpes simplex 1. E’ stato quindi costruito il Toll-like receptor 3-specific connectome (vedi bellissima Fig. 2 con l’individuazione di 601 geni con la minor distanza biologica tra loro). Sono stati preparati connettomi umani gene-specifici disponibili in http://lab.rockefeller.edu/casanova/HGC, che, come dicono gli AA, faciliterà la selezione genome-wide di geni candidati per la loro successiva validazione sperimentale.
Vedi anche Connectome.PNAS 2013;110:5739. Termine coniato nel 2005 per indicare il piano fotografico strutturale (blueprint) del cervello umano, che consente di stabile una connessione tra struttura e funzione e di fornire 3 livelli di informazione: visione panoramica delle aree cerebrali e dei pathway neuronali, un’immagine precisa della popolazione neuronale e dei loro circuiti e una visione da vicino dei singoli neuroni e delle loro connessioni sinaptiche. Il passo al connettoma genetico è stato breve nel tentativo di verificare a livello biologico quello che si poteva ipotizzare a livello morfologico per capire lo sviluppo cerebrale, quello che succede nell’invecchiamento e nelle malattie. Ma con molti limiti anche se le prospettive sono buone.

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A gene of rare effect. Nature 2013;496:152. Sottotitolo: A mutation that gives people rock-bottom cholesterol levels has led geneticists to what could be the next blockbuster heart drug (sottotitolo personale: una bellissima storia contata però, in questa News and Views, come uno spot pubblicitario con commenti tipo “Wow” e “sei la migliore”). In sintesi: riscontro casuale in una signora di 40 anni afro-americana con livelli di LDL di 14 mg/dL (vn 100) di due mutazioni inattivanti, una materna e una paterna, di un gene, PCSK9, una serin proteasi che riduce LDL epatico e extraepatico e che aumenta i suoi livelli nel sangue (OMIM *607786. variante allelica .0007.  AJHG 2066;79: 514). Questa persona è stata individuata nell’ambito di uno studio sulla aterosclerosi che voleva verificare la distribuzione dei livelli di LDL nella popolazione (ARIC). Come prevenzione della patologia aterosclerotica le statine vanno bene ma oltre il 20% dei pz non le tollera. Ovviamente le compagnie farmaceutiche, per l’enorme mercato che si spalanca, sono molto interessate e hanno in corso sperimentazioni cliniche in fase III con anticorpi specifici, ma un po’ i costi e un po’ il fatto che il farmaco deve essere iniettato, rende secondo alcuni, questa opzione terapeutica non facile. E anche se sinora non ci sono rilevanti effetti collaterali al nuovo farmaco ci sono alcuni allarmi dai modelli animali, come il fatto che il silenziamento del gene PCSK1 nello zebrafish è letale in epoca embrionale. Ma il composto eterozigote con ambedue le mutazioni inattivanti trovato nella signora 40enne fa bene sperare (noi e le industrie). Ma quando cominciare la terapia? Sui 30 anni? Per ora ci si limita a vederne l’effetto in adulti  con alti livelli circolanti di LDL (e anche vedere come starà in futuro la signora-cavia, ndr).

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Identification of seven loci affecting mean telomere length and their association with disease. Nature Genetics 2013;45:422 (vedi anche sopra. Pg. 371). I telomeri sono costituiti da proteine e centinaia di sequenze esanucleotidiche ripetute di DNA delle parti terminali dei cromosomi, sono importanti per la stabilità genomica e la protezione dalla riparazione DNA inappropriata. Nella replicazione somatica la loro lunghezza si riduce, ma nelle cellule germinali e nelle cellule staminali è mantenuta la lunghezza dei telomeri da una ribonucleoproteina, telomerasi, che contiene il prodotto del gene TERT che è la subunità catalitica della trascrittasi inversa telomerasica. L’eccessiva brevità dei telomeri determina la morte cellulare.
Mutazioni germinali di TERT determinano brevità dei telomeri e sono causa di alcune patologie, tra cui la Discheratosi congenita caratterizzata da insufficienza midollare, fibrosi epatica e polmonare e
suscettibilità a cancro e Fibrosi polmonare e insuff. midollare (Pulmonary Fibrosis, Bone Marrow Failure, and Telomerase Mutation. NEJM Letter 2012;366:1551)(selezione articoli Apr 2012). La lunghezza media telomerica può essere molto diversa da individuo a individuo e ha un’alta ereditabilità (44-80%). C’è una correlazione negativa tra lunghezza telomerica e età (riduzione di 20-40 pb/a). Brevità, corretta per età e sesso (le femmine hanno telomeri più lunghi), sembra correli con molte malattie età dipendenti tra cui la m. coronarica e è ipotizzabile che possa essere considerato come un marker di invecchiamento (ma mancano studi prospettici della lunghezza dei telomeri dei leucociti e rischio di malattie, anche se ci sono laboratori che a pagamento- 500 euro- offrono il test telomerico per conoscere il proprio rischio di malattia. Vedi Science 2011;332:414. Are Telomere Tests Ready For Prime Time? Selezione articoli Giu-Set 2011). Lunga premessa per commentare i risultati della meta-analisi di GWAS su un’ampia popolazione di origine europea (37.684 persone e successive altre 10.739). Associazione significativa alla lunghezza telomerica leucocitica con 7 loci (5 nuovi),  5 di questi sono loci che contengono geni candidati per la lunghezza telomerica (TERC, TERT, NAF1, OBFC1 and RTEL1). Lead SNP (SNP che sono statisticamente associati a un fenotipo) di due loci (TERC and TERT) sono associati a alcuni tipi di cancro e altre malattie tra cui la fibrosi polmonare idiopatica. La stima dell’”effetto per allele” sulla lunghezza telomerica è modesta (~57 pb – 117 pb). SNP di TERC e TERT associati significativamente a telomeri corti (ma anche lunghi) sono a rischio di patologie, tra cui il cancro. Una di queste, la più nota, e brevità dei telomeri e malattia coronarica. E’ stata condotta un’analisi di rischio genetico combinando le varianti dei 7 loci (22.233 casi con malattia coronarica e 64,762 controlli) che ha rilevato un’associazione significativa con alleli associati a telomeri brevi e un aumento di rischio cumulativo (non per singolo locus) del 21% (95% IC 5–35%) per deviazione standard di lunghezza telomerica.

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Sorting receptors at Down’s syndrome synapses. Nature Medicine 2013;19:404. Sottotitolo: Trisomy 21 triggers multiple potential routes to intellectual disability in Down’s syndrome. A new study suggests that aberrant endosomal function may contribute to the neuronal deficits behind learning and memory impairments in affected individuals. Commento di un articolo sullo stesso fascicolo (Loss of sorting nexin 27 contributes to excitatory synaptic dysfunction by modulating glutamate receptor recycling in Down’s syndrome. Nature Medicine Pg. 473). Per il mantenimento della funzione sinaptica è necessario un continuo rifornimento di proteine e questo rifornimento è garantito da un network di endosomi neuronali che regolano la degradazione e il recupero delle proteine sinaptiche come i recettori dei neurotrasmettitori. Le disfunzioni endosomiche sono i primi segni delle malattie sinaptiche, le sinaptopatie come la  S. Down e l’Alzheimer. Il prodotto del gene SNX27 (sorting nexin 27) interagisce con vari recettori neuronali e canali ionici e, con i dati di questo lavoro, sembra essere coinvolto nella trasmissione glutammatergica. Nel lavoro il topo KO di Snx (Snx27−/−) ha gravi deficit neuronali dell’ippocampo e della corteccia e il topo eterozigote Snx27+/−, che non ha anomalie morfologiche cerebrali, ha però difetti della funzione sinaptica, di apprendimento e di memoria associati a una riduzione dei recettori ionotropici del glutammato (NMDA e AMPA). Nella s. Down vi è sovraespressione di un microRNA, miR-155, che regola negativamente C/EBPβ (che è parte della famiglia C/EBP di fattori di trascrizione composta da sei membri che promuovono l’espressione di alcuni geni interagendo con i promotori) riducendo l’espressione di SNX27 e alterando lo smistamento (sorting) delle proteine endosomiche e di conseguenza riducendo l’espressione del recettore del glutammato nelle sinapsi dell’ippocampo. Come effetto si produce una disfunzione sinaptica. Normalizzando l’espressione di Snx27 nell’ippocampo di topi-modello della trisomia 21 adulti (modello Ts65Dn, che ha un piccolo cromosoma extra derivato dal cromosoma 16 del topo, con trisomia di circa la metà dell’ortologo 21 dell’uomo) si ha un miglioramento delle funzioni sinaptiche, dell’apprendimento e della memoria.
Nota di cautela: l’intero interattoma della trisomia 21 è ampio con una sovraespressione di molti geni (~550) e miRNA (19) e ogni tappa del pathway identificato in questo studio (miR-155–C/EBPβ–SNX27) ha più azioni. miR-155 regola circa 140 geni, tra cui il gene codificante C/EBPβ. Pur nella complessità della patogenesi di questa frequente condizione si incomincia a dare un certo ruolo agli endosomi e a prospettare una possibile terapia usando anticorpi anti-miR-155.

Somatic mutations in ATP1A1 and ATP2B3 lead to aldosterone-producing adenomas and secondary hypertension. Nature Genetics 2013;45:440. L’aldosteronismo primitivo (aumentata secrezione autonoma di aldosterone da parte delle surrenali) determina grave ipertensione (7% degli ipertesi) resistente alla terapia (20% degli ipertesi con farmacoresistenza) e grave ipopotassiemia con rischio di morte e, a lungo termine, di incidenti vascolari. Nel 60% dei casi vi è un adenoma (mono o bilaterale) che produce aldosterone (APA). Vi sono casi familiari e sporadici da mutazione del gene KCNJ5 (canale del potassio)(MIM #613677) e il 30-40% degli APA ha una mutazione di questo gene.
Per identificare altri geni è stata applicata la tecnica del sequenziamento esonico nei tumori e in altri tessuti di controllo in 9 soggetti con aldosteronismo primitivo ipopotassiemico che non avevano una mutazione somatica di KCNJ5. Sono state trovate in 3 pz mutazioni nel gene ATP1A1, che codifica una Na+/K+ ATPasi subunità e in 2 pz una mutazione del gene ATP2B3 (locus sul cromosoma X) che codifica una Ca2+ ATPasi. Queste ATPasi sono espresse nelle cellule del surrene e controllano l’omeostasi ionica del sodio, potassio e calcio. La mutazione è in mosaico nell’adenoma e non è presente nel tessuto circostante o nel sangue. L’analisi di ulteriori 308 adenomi ha consentito di identificare una mutazione somatica in eterozigosi del gene ATP1A1 (5.2% dei casi) e del gene ATP2B3 (1.6% dei casi). Nei 308 adenomi sono state trovate mutazioni del gene KCNJ5 nel 38.3% dei casi. I pz con la mutazione somatica hanno, rispetto ai pz senza mutazione, una maggior frequenza nei maschi (a differenza delle mutazioni di KCNJ5 che sono più frequenti nelle femmine), alti livelli pressori e ipopotassiemia. Pz con forme familiari o con aldosteronismo primitivo non sono risultati portatori di mutazione germinale di ATP1A1 o di ATP2B3.

Merlin isoform 2 in neurofibromatosis type 2–associated polyneuropathy. Nature Neuroscience 2013;16:426. I neuroni del SNC e periferico sono complessi cellulari altamente polarizzati. Nell sviluppo sono necessarie numerose fasi morfologiche responsabili della funzionalità e della plasticità del sistema nervoso. I neuroni migrano nelle sedi prestabilite, sviluppano e estendono gli assoni e i dendriti nelle regioni appropriate e formano contatti sinaptici tra loro. Questi complessi processi di formazione di network avvengono sotto controllo spazio-temporale da parte di prodotti di geni della famigli Rho di piccole GTPasi che svolgono un’importante funzione di controllo dello sviluppo.  Non si conosce come questa complessa organizzazione avvenga. Nella Neurofibromatosi tipo F2, malattia AD da mutazione del gene che codifica la Merlina (dai ricercatori francofoni chiamata più appropriatamente schwannomina, vecchia polemica, ndr) oltre allo sviluppo di tumori (schwannomi) si ha frequentemente un segno clinico caratteristico costituito da una neuropatia periferica focale, indipendentemente dal tumore. Perché? Perché, il lavoro prova, l’isoforma Merlina-iso2 serve per il mantenimento dell’integrità neuronale e il deficit di dose genica NF2 è la causa dell’assonopatia. Come? Merlina-iso2 favorisce l’attivazione RhoA GTPasi promuovendo la fosforilazione dei neurofilamenti a catena pesante. Il topo con deficit di Merlina-iso2 hanno alterata motricità, ritardo di reazione sensoriale e anomalie EMG tipiche della neuropatia assonale. Il nervo sciatico dei pz con NF2 e di questi topi hanno una ridotta fosforilazione delle subunità H dei neurofilamenti e ridotta spaziatura dei neurofilamenti e assoni morfologicamemente alterati. Quindi questa isoforma è importante per l’integrità assonale e è la causa della neuropatia focale tipica della NF2 (12% dei pz).

Immagini: Elephantiasis Neuromatosa. NEJM 2013;368:e23. Termine che definisce un’ipertrofia di un arto da neurofibroma massivo dei tessuti molli che è piuttosto raro e che, come nel caso presentato, si presenta in genere nella Neurofibromatosi 1 (vedi l’immagine di un arto inferiore in una donna di 22 anni che dall’età di 8 anni si è accorta della presenza di questa massa cresciuta poi molto lentamente).
E’ stata sottoposta a intervento chirurgico per ridurre parzialmente (debulking) la massa per alleviare il dolore e per motivi estetici.

Competition intensifies over DNA-based tests for prenatal diagnoses. Nature Medicine 2013;19:381.  Una nuova compagnia, Natera, ha annunciato che ha lanciato un suo test non invasivo da sangue materno per la diagnosi prenatale delle anomalie cromosomiche con la stessa sensibilità dei test invasivi.
Il test è con SNP, la sensibilità del 92-99%, l’accuratezza diagnostica del 100%, a 9sg e al prezzo di 1.500 D USA. Le altre compagnie offrono lo screening con sequenziamento massivo in parallelo (costo di 1.500 Verifi,  di 2.760 (?) Sequenom’s MaterniT21 PLUS) o con sequenziamento di specifici cromosomi  al prezzo di 800 D USA Ariosa’s Harmony.

KIAA1199, a deafness gene of unknown function, is a new hyaluronan binding protein involved
in hyaluronan depolymerization. PNAS 2013;110:5612. Mi pare ci sia una sola pubblicazione del 2003 di AA giapponesi che riportano 4 mutazioni missenso del gene KIAA1199 come causa di una forma di sordità non sindromica. In questo lavoro viene attribuita una specifica funzione a questo gene di legare ialuronano (acido ialuronico), che è un glicosaminoglicano a alto peso molecolare ubiquitario presente come maggior costituente della matrice extracellulare fornendo integrità funzionale alle cellule e agli organi. E’ coinvolto in alcune patologie come la s. Werner (sindrome progerioide dell’adulto), dove è sovraespresso.

ATP signaling enables adaptation to loud Sounds. PNAS 2013;110:7100. Commento di un lavoro sullo stesso fascicolo (ATP-gated ion channels mediate adaptation to elevated sound levels. Pg 7494). L’orecchio dei mammiferi sente sia il sussurrio che l’acuto di una sirena e sappiamo anche che la coclea trasduce segnali forti senza che ci siano danni uditivi nonostante sia altrettanto noto che rumori forti e persistenti possono peggiorare la perdita dell’udito dovuta all’eta. Viene dimostrato che segnali forti fanno liberare ATP nella coclea attivando le proteine recettoriali P2X2 e riducendo la trasduzione e la trasmissioen sinaptica dalel cellule cocleari. Il topo nullo del gene P2RX2, che codifica i recettori P2X2, è più vulnerabile al danno permanente dell’udito rispetto al controllo perchè manca della risposta protettivo dell’udito, chiamata “spostamento temporaneo della soglia” (temporary threshold shift), quando sono esposti a rumori di 85 dB.

Role of p63 and the Notch pathway in cochlea development and sensorineural deafness. PNAS 2013;110:7300. La proteina tumorale p63 (TRP63) fa parte della famiglia di fattori di trascrizione p53 e ha un rulo chiave nell’embriogenesi. La sua espressione è regolata da 2 promotori, solo uno dei quali (TAp63) contiene il dominio TA N-terminale critico per l’induzione trascrizionale di alcuni geni bersaglio di p63, mentre l’altra isoforma (ΔNp63) no. Ambedue hanno, per splicing alternativo, altre isoforme (α, β, γ). Il gene codificante (Tumor Protein p63)(TP63) è il gene malattia di varie condizioni (s. ADULT, s. EEC, s. Limb-mammary, s. Oral facial cleft 8, s. Rapp-Hodgkin, s. Spil-hand/foot malformation 4)(vedi MIM 603723), tra cui alcune con displasia ectodermica, come EEC, con una buona correlazione genotipo-fenotipo in base al dominio interessato dalla mutazione. Ma oltre al coinvolgimento ectodermico nella EEC c’è anche un coinvolgimento cocleare con sordità. Il topo nullo p63 mostra difetti morfologici dell’organo Corti con cellule ciliate soprannumerarie, fenotipo dovuto alla perdita di TAp63, che normalmente agisce attivando il pathwaty Notch per la formazione della coclea. Lo studio nel modello animale (analisi di espressione genica e analisi morfologica) dimostra quindi che p63, tramite il pathway Notch, partecipa in maniera rilevante allo sviluppo dell’organo Corti fornendo una spiegazione molecolare alla sordità neurosensoriale presente nei pz con displasia ectodermica e mutazione di questo gene.

Exploring the erythroblastic island. Nature Medicine 2013;19:399. News and views di due articoli sulla eritropoiesi e sui macrofagi con implicazioni terapeutiche (Macrophages support pathological erythropoiesis in polycythemia vera and β-thalassemia. Nature Medicine Pg. 437. L’eritropoiesi, processo dinamico e complesso in cui le cellule progenitrici eritroidi diventano globuli rossi senza nucleo, che hanno una breve emivita e che devono essere continuamente prodotte. Oltre alla nota eritropoietina (Epo) in questa continua e regolata produzione agiscono vari fattori di crescita e il microambiente tra cui i macrofagi che oltre a svolgere funzioni note (riutilizzo del ferro degli eritrociti senescenti e di sovraccarico di nuclei degli eritroblasti) sembra che partecipino attivamente alla proliferazione e alla sopravvivenza degli eritroblasti. La funzione di stimolo eritropoietico del microambiente è particolarmente importante nelle condizioni di stress eritropoietico come nelle condizioni di anemia o in alcune malattie come la β-talassemia (anemia cronica da ridotta sintesi β-globinica) e la policitemia vera (aumento dell’eritrocitosi da mutazione attivante della tirosin chinasi JAK2), in cui l’eritropoiesi si estende in sedi extramidollari (milza e fegato) aumentando il pool delle cellule progenitrici. Nel modello animale di diverse condizioni di stress, anemia, somministrazione di EPO, policitemia vera e di β-talassemia) si dimostra un decisivo contributo dei macrofagi nella patologia e la loro riduzione mediante somministrazione endovena di clodronato (della classe dei bifosfonati, ndr) è in grado di correggere la progressione delle anomalie ematologiche delle due malattie genetiche modulando la proliferazione e la differenziazione eritroide. In particolare nella β talassemia le deplezione dei macrofagi riduce la proliferazione e aumenta la differenziazione determinando una ridotta reticolocitosi, splenomegalia e l’ematopoiesi extramidolarre. In vitro (colture primarie umane) di pz e controlli si osserva un impatto diretto dei macrofagi nella proliferazione e enucleazione degli eritroblasti.
Conclude il lavoro, citando un lavoro (CD169+ macrophages provide a niche promoting erythropoiesis under homeostasis and stress. Nat. Med. advance online publication, doi:10.1038/nm.3057. 17 March 2013) e suggerisce una possibile terapia complementare, insieme a quelle già in uso, per queste malattie.

Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature 2013;496:445. Review sui macrofagi e sul loro ruolo nello sviluppo e nelle malattie (neurodegenerative, osteoporosi, osteopetrosi, leucemia, aterosclerosi, fibrosi, cancro e metastasi, obesità e diabete, artrite, malattia infiammatoria intestinale). Con futuri sviluppi e possibili terapie.

Disruption of the principal, progesterone-activated sperm Ca2+ channel in a CatSper2-deficient
infertile patient. PNAS 2013;110:6823. I canali ionici sono proteine di membrana che consentono lo scambio di ioni (Na+, K+, Ca2+ e Cl-) tra cito­plasma  e spazio extracellulare se­condo il loro gradiente elettrochimico. Sono presenti anche negli spermatozoi e implicati nella fertilizzazione, nella mobilità, nella individuazione e nel legame con la cellula uovo (capacitazione acrosiomiale). Un effetto iperattivante (mobilità, capacitazione) degli spermatozoi da aumento del calcio intracellulare è determinato dai livelli di progesterone nelle vie rirpoduttive femminili. Difetti del canale cationico associato agli spermatozoi (CatSper) causano completa infertilità isolata, anche nell’uomo. Ma deve essere ancora verificata l’importanza di CatSper (complesso di più subunità 1-4 e almeno altre due proteine CatSperB e G, vedi MIM *606389) nella fertilizzazione e il meccanismo con cui opera, anche perché manca il modello animale di perdita di funzione di questo gene in quanto nel topo manca l’azione attivante del progesterone. Studi in vitro con spermatociti di un maschio con mutazione dimostrano che CatSper è il principale canale del calcio spermatico e che è fortemente potenziato dal progesterone, con sensibilità all’ormone che inizia molto presto nella fase di sviluppo del gamete e che raggiunge l’acme al momento della eiaculazione.

Deciphering the Glycosylome of Dystroglycanopathies Using Haploid Screens for Lassa Virus Entry. Science 340:479. Il commento sullo stesso fascicolo titola “Viruses and Congenital Disorders”. L’α-distroglicano (αDG ) lega la matrice extracellulare con il citoscheletro e è modificato da catene di zuccheri tra cui un O-linked glicano (i glicani sono polisaccaridi che con le proteine o i lipidi delle membrane cellulari formano le glicoproteine o i glicolipidi di membrana). Mutazioni di geni della glicosilazione αDG causano le districanopatie tra cui una distrofia muscolare con interessamento cerebrale e anomalie oculari (Muscular-eye-brain disease o s. Walker-Warburg) causata da mutazioni di una glicosiltrasferasi (sono almeno 8 i geni geni e molti altri non ancora noti in quanto nel 50% dei casi non si conosce ancora il gene malattia) che determina un alterato legame di αDG con i suoi ligandi come la Laminina. L’unità O-linked glicano è anche la porta di ingresso di patogeni come il micobatterio della lebbra, il virus Lassa (febbre emorragica responsabile di migliaia di morti all’anno) e altri virus. Gli AA hanno ricercato geni coinvolti nella O-glicosilazione responsabili dell’infezione dal virus Lassa e hanno identificato in 3 su 28 famiglie con pz affetti da s. Walker-Warburg, negative ai geni noti, una mutazione con perdita di funzione di altri due geni che sono da considerare geni-malattia di questa grave patologia neurologica. L’utilità quindi dello studio del  “glicosiloma” per individuare cause di patologie geneticamente eterogenee.

Epigenetics: Core misconcept. Opinion. PNAS 2013;110:7101. Critica (anche piuttosto aspra come vedrete) dell’articolo Core Concept Epigenetics. PNAS 2013;110:3209 (Spigolature Feb 2013). L’A. della ”Opinione” inizia dicendo che l’articolo parte bene sottolineando che le cellule di un organismo pur avendo le stesse informazioni genetiche hanno delle specifiche proprietà, ma poi trascura la massa di conoscenze sinora raccolte e le sostituisce con pareri personali presentati come fatti. E allora dopo una panoramica dei dati sulla epigenetica che si conoscono, critica il Core Concept punto per punto, ad es. sulla stessa definizione di epigenetica e conclude così: Labeling histone modifications “epigenetic,” moreover, obscures what we know. The Core Concepts article discussed here is a good example, further muddying (intorbidando ulteriormente) the waters. The important point is to attend to how things actually work”.

AUTOFAGIA: processo omeostatico presente in tutte le cellule eucariotiche che partecipa al sequestro di componenti citoplasmatiche negli autofagosomi a doppia membrana, che poi si fondono con i lisosomi per la degradazione del sequestrato e il riuso (vedi review citata nelle Spigolature Feb 2013: Mechanisms of Disease. Autophagy in Human Health and Disease. NEJM 2013;368:651). E’ un meccanismo che contribuisce alla fisiopatologia di molte malattie, che a fini clinici può essere stimolato con farmaci, ma quelli noti hanno effetti pleiotropici per cui c’è la necessità di avere specifici induttori di autofagia.
Targeting autophagy for disease therapy. News and Views Nature Biotechnology 2013;31:322. Sottotitolo: A peptide that enhances autophagy suppresses viral infections and clears protein aggregates. Il riciclo cellulare, l’autofagia, è stato chiamato in causa in varie condizioni, dal cancro all’invecchiamento, alle infezioni e a malattie metaboliche. Vengono degradate proteine intracellulari e organelli alterati e riciclati in precursori metabolici durante lo stress cellulare e vengono anche eliminati patogeni intracellulari, patogeni che si sono attrezzati con strategie difensive che hanno come bersaglio la proteina cruciale del pathway autofagico, beclin-1 che regola l’induzione dell’autofagia. Per comprendere i meccanismi attivanti l’autofagia gli AA (Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide. Nature 2013;494:201) sono ricorsi a proteine virali che hanno come bersaglio beclin-1 per verificare il dominio funzionale regolatorio dell’autofagia. Identificato il segmento peptidico (18 aa) e ne hanno studiato l’azione individuando una proteina legante che inibente beclin-1. La somministrazione del segmento peptidico annulla, per competizione, l’effetto legante liberando beclin-1 libera di svolgere il suo effetto.
In sintesi il peptide potrebbe essere uno strumento terapeutico per rimuovere patogeni intracellulari e quindi essere usato per le varie patologie da deficit di autofagia (es. m. Huntington, Parkinson e Alzheimer).

Integrated Systems Approach Identifies Genetic Nodes and Networks in Late-Onset Alzheimer’s Disease. Cell 2013;153:707.  L’Alzheimer a inizio tardivo è una malattia complessa da combinazione di fattori genetici e non genetici che agiscono su un network molecolare responsabile della malattia. Per caratterizzare il sistema molecolare di questa patologia a insorgenza tardiva (LOAD) sono stati analizzati i tessuti cerebrali postmortem di 1.647 pz (con relativi controlli) mediante analisi genetica NGS e di espressione genica dell’intero genoma. Sono stati individuati vari moduli di categorie funzionali e di specificità cellulare, che sono stati ordinati per rilevanza nel determinare la patologia cercando di individuarne i principali regolatori. Il primo nell’ordine di importanza è il network immunitario/microglia che comprende TYROBP (Protein Tyrosine Kinase Binding). Questi risultati sono utili per comprendere la fisiopatologia di questa frequente malattia e soprattutto per ordinare per priorità i pathway convolti e i individuare i possibili bersagli molecolari per la terapia.

De novo mutations in the autophagy gene WDR45 cause static encephalopathy of childhood with neurodegeneration in adulthood. Nature Genetics 2013;45:445. L’encefalopatia stazionaria dell’infanzia con neurodegenerazione in età adulta (NBIA) è un gruppo eterogeneo clinicamente e geneticamente (di locus) malattie neurodegenerative con segni extrapiramiali e deficit intellettivo associato a depositi di ferro nei gangli basali. E’ stato recentemente riconosciuto un sottogruppo clinico di NBIA (SENDA) con ritardo psico-motorio, stazionario sino all’età adulta, che poi verso i 20-30 anni evolve improvvisamente in distonia progressiva, parkinsonismo e demenza; oltre ai depositi di Fe nel globo pallido e nella sostanza nigra questi pz hanno caratteristiche distintive alla RM cerebrale. Il sequenziamento esonico in due pz con SENDA (non esistente in OMIM) ha individuato una mutazione in eterozigosi del gene WDR45 (in Xp11.23), e il sequenziamento Sanger ha trovato mutazioni, sempre in eterozigosi, in altri 3 pz. In due è stato individuata un’anomalia di splicing e in tutti 5 una rilevante riduzione di espressione della proteina codificata. Per chi interessato c’è nell’articolo una buona descrizione clinica. Come nel lievito, questa proteine ha un importante ruolo nell’autofagia e ridotta attività autofagica è stata documentata nella linea linfoblastoide dei pz. L’effetto sembra limitato al SNC anche se il gene è espresso in molti tessuti.

Dangerous duet: LRRK2 and ɑ-synuclein jam at CMA. Nature Neuroscience 2013;16:375. News & Views dei risultati di uno studio (Interplay of LRRK2 with chaperone-mediated autophagy. Pg. 394) che ha questo sottotitolo “A report suggests that leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) can be degraded through chaperone-mediated autophagy (CMA) in the lysosome, and several Parkinson’s disease–causing LRRK2 mutants impair CMA-mediated selective degradation of cytosolic substrates”.
Il blocco il lavoro cellulare con l’accumulo di proteine malripiegate e di aggregati proteici può essere la causa delle principali malattie neurodegenerative. Nell’Alzheimer, Parkinson e m. Huntington è stato documentata un’alterazione dei due pathway proteolitici, il sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) e i lisosomi. Ma non si sa come i diversi fattori di malattia interferiscano con la funzione proteolitica e se sia possibile favorire la funzione di uno di questi sistemi per degradare e eliminare l’accumulo di prodotti tossici. Nel lavoro viene studiato il pathway di degradazione della proteina LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2), la proteina più frequentemente mutata nel Parkinson familiare (MIM #607060, Parkinson 8), che, quando mutata, blocca una forma specifica di degradazione lisosomiale (CMA)(chaperone-mediated autophagy), importante meccanismo di autofagia che libera nei lisosomi il 30% delle proteine citosoliche per la loro degradazione. I substrati CMA hanno target CMA specifici sulla loro superficie sede di legame del chaperone citosolico hsc70. Il complesso substrato-hsc70 viene riconosciuto da LAMP-2A (lysosome-associated membrane protein type 2A) che agisce come un recettore della membrana lisosomiale e trasporta selettivamente all’interno il materiale per la degradazione.
Nel lavoro viene studiato il meccanismo di degradazione cellulare della proteina LRRK2; quando mutata è “maldigerita” (i lisosomi sono il sistema digestivo cellulare, ndr) perché è alterato uno dei motivi strutturali richiesto per il legame chaperonico. Tappa necessaria per CMA e per la degradazione proteica specifica. Nel lavoro viene anche suggerito il coinvolgimento dell’altro pathway, quello del sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) che insieme alla macroautofagia è coinvolto nella degradazione della proteina mutante probabilmente per il blocco di CMA. Il blocco CMA determina anche l’accumulo di α-synucleina, che è il principale componente dei corpi Lewy nei neuroni in degenerazione, il tipico segno istologico del Parkinson. Importanti conoscenze per una terapia.

PINK1-Phosphorylated Mitofusin 2 Is a Parkin Receptor for Culling Damaged Mitochondria. Science 2013;340:471. I mitocondri “da rottamare” sono eliminate con un meccanismo mitofagico (autofagia selettiva dei mitocondri) con l’azione del prodotto di due genic he mutate causano il Parkinson, PINK1 (PTEN-induced putative kinase protein 1) e l’E3 ubiquitina ligasi Parkina. Non si sa come interagiscano queste due proteine e partecipino alla eliminazione dei mitocondri danneggiati. Nel lavoro in vitro si dimostra che proteine della membrana esterna dei mitocondri, Mitofusina  (Mfn) 1 e 2, sono substrati di Parkina. La funzione di Mfn 2 è di fungere da recettore mitocondriale della Parkina e è richiesta per il controllo di qualità dei mitocondri cardiaci.

MALATTIE COMPLESSE/STUDI ASSOCIAZIONE
Missing in action. Nature Reviews Genetics 14 April 2013. Research Highlight di un articolo (Finding the sources of missing heritability in a yeast cross. Nature 2013;494:234). Dibattito acceso in Genetica umana sulla “missing heritability”, che è la ridotta proporzione di variazioni fenotipiche ereditabili che può essere spiegata dai loci sinora identificati (riportato in alcune selezioni Spigolature del Gennaio 2012 e Settembre 2012 con commento di due articoli: Epistasis dominates the genetic architecture of Drosophila quantitative traits. PNAS 2012;109:15553 e The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability. PNAS 2012;109:1193). Da tempo vi sono prove del ruolo di interazioni epistatiche (interazione non lineare tra loci polimorfici dei caratteri quantitativi) in vari organismi (mammiferi e non). Nello studio su Nature che viene commentato ci sono elementi per ritenere che una possibile spiegazione risieda nella necessità di un’ampia dimensione del campione in studio che favorisca l’identificazione di nuovi loci. Infatti nel lievito è stata possibile l’identificazione di molti loci, ognuno con un piccolo effetto sul fenotipo, che spiega buona parte delle ereditabilità in “senso stretto” (l’ereditabilità in cui i fattori genetici hanno un effetto additivo).

Trans-Ethnic Fine-Mapping of Lipid Loci Identifies Population-Specific Signals and Allelic Heterogeneity That Increases the Trait Variance Explained. PLoS Genetics 2013;9:e1003379. Commentato da Science 2013;340:121. Relying on Our Ancestors. Ci sono differenze tra popolazione e popolazione di linkage disequilibrium, che è la perdita di associazione di alleli contigui, dovute a migrazioni e evoluzione divergente. Negli studi di associazione  genome-wide, che sono test di associazione tra marcatori genetici e caratteri fenotipici, queste differenze sono causa di scarsa significatività associativa e “missing heritability” che richiedono, per essere individuati, l’analisi di un gran quantità di soggetti. La maggior diversità di aplotipi in alcuni gruppi ancestrali, come nella popolazione africana, può facilitare la localizzazione di varianti funzionali che per un ridotto linkage disequilibrium hanno un segnale associativo meno significativo. Nel lavoro sono stati cercate varianti associate al metabolismo lipidico (trigliceridi, lipoproteine a alta e a bassa densità) in popolazioni di discendenza africana, asiatica e europea: sono state osservate variazioni complesse in loci noti e anche nuovi loci associati con i livelli lipidici.
La genotipizzazione trans-etnica conferma la presenza di eterogeneità allelica, consente l’identificazione di nuovi loci, di varianti specifiche di popolazione e limita il numero di SNP candidati per studi funzionali.

Predicting the influence of common Variants. Nature Genetics 2013;45:339. Editoriale sugli studi di associazione dell’intero genoma (GWAS) per malattie comuni e non comuni che ne sottolinea i notevoli risultati (la scoperta del contributo genetico per oltre 700 malattie complesse comuni) ma nello stesso tempo ne precisa anche i limiti, che sono la mancata identificazione dell’intera ereditabilità (“missing heritability”)(The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability. PNAS 2012;109:1193) e la limitata applicazione clinica per la previsione di rischio.
Sono pubblicati in questo fascicolo i risultati di varie ricerche con GWAS. In particolare quelli ottenuti dallo studio multicentrico Collaborative Oncological Gene-environment Study (COGS) per identificare i fattori genetici di suscettibilità a 3 tumori comuni ormone-dipendenti quali il seno (130 centri), ovaia (100 centri) e prostata (70 centri) (iCOGS collection provides a collaborative Model. Pg 343). NB: Illumina rende possibile l’accesso libero degli articoli di questo Focus per i prossimi 6 mesi.
Il commento (Public health implications from COGS and potential for risk stratification and screening. Pg 349) presenta in sintesi i risultati per la stratificazione di rischio per questi tre tumori (sono stati individuati 49 nuovi loci per il cancro del seno, 8 per il cancro delle ovaie e 23 per il cancro prostatico). Questi dati sono inseriti in programmi di salute pubblica per la prevenzione già in atto di queste comuni patologie. Le pubblicazioni sono:
Large-scale genotyping identifies 41 new loci associated with breast cancer risk. Pg. 353
GWAS meta-analysis and replication identifies three new susceptibility loci for ovarian cancer. Pg. 362.
Multiple independent variants at the TERT locus are associated with telomere length and risks of breast and ovarian cancer. Pg. 371.
Genome-wide association studies identify four ER* negative–specific breast cancer risk loci. Pg. 392 (*Estrogen receptor negative)

Altre pubblicazioni GWAS sullo stesso fascicolo.
Projecting the performance of risk prediction based on polygenic analyses of genome-wide association studies. Nature Genetics 2013;45:400, in sui si dimostra che l’utilità di modelli poligenici per la previsione del rischio dipende dalle dimensioni del campione, dall’architettura genetica e dall’inclusione, nel calcolo del rischio, di altri fattori clinici tra cui l’anamnesi familiare (vedi anche Comparison of family history and SNPs for predicting risk of complex disease. PLoS Genetics2012;8: e1002973)(commentato in Nature Reviews Genetics 2012;13, Complex Disease. Family history versus SNPs for disease predictions)(Spigolature Dic 2012).

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Polygenic familial hypercholesterolaemia: does it matter? Lancet 2013;381:1255. Ipercolesterolemia familiare: >1:500 persone. Vi sono aumentati livelli ematici dalla nascita di lipoproteine a bassa densità (LDL-C), che se non trattata (statine) porta a precoci e ricorrenti incidenti cardio-vascolari, da mutazione del recettore LDL (LDLR), di cui sono note oltre 1200 mutazioni, e meno frequentemente di APOB o PCSK9.Si sta facendo largo l’idea che piuttosto che ricorrere allo screening biochimico (LDL-C) si potrebbe più  efficacemente ricorrere allo screening genetico “a cascata” nella famiglia partendo da un caso indice. Ma solo nel 40% delle persone con sospetta ipercolesterolemia familiare si trova la mutazione. Nel lavoro a cui il commento fa riferimento (Use of low-density lipoprotein cholesterol gene score to distinguish patients with polygenic and monogenic familial hypercholesterolaemia: a case-control study. Pg. 1293) è stato studiato un ampio campione di pz con ipercolesterolemia familiare e di controlli analizzando 12 comuni alleli noti per dare aumentati livelli di LDC-C. E’ stato calcolato un punteggio genetico tra i casi familiari (321), quelli con mutazione di un gene noto (vedi sopra)(319) e i controlli (3020). Risultati: una buona proporzione di pz con ipercolesterolemia familiare senza mutazione ha un punteggio genetico alto rispetto ai controlli, facendo pensare a un effetto poligenico, che potrebbe compromettere lo screening “a cascata”. Ma, dato altrettanto interessante, anche nei pz con mutazione nota c’è evidenza di un effetto poligenico che potrebbe spiegare la notevole variabilità della penetranza anche con la stessa mutazione (le malattie monogeniche che monogeniche non sono, ndr). Viene presentato un interessante percorso diagnostico a tappe con il reclutamento basato sulla ipercolesterolemia familiare per coloro che hanno ma anche per quelli in cui non è stata trovata la mutazione dei geni su riportati.

Seven new loci associated with age-related macular degeneration. Nature Genetics 2013; Nature Genetics 2013;45:433. La degenerazione maculare correlate con l’età è malattia neurodegenerativa con un’importante ereditabilità clinicamente caratterizzata da perdita della visione centrale per la morte dei fotorecettori e è la principale causa di cecità per le persone di età oltre i 63 anni. I geni noti che contribuiscono a questa patologia sono quelli del sistema del complemento e una regione del cromosoma 10 e altri geni indicati da studi di associazione. Per definire meglio i loci implicati e identificarne altri è sorto un consorzio di 18 gruppi di ricerca (AMD Gene Consortium) che ha analizzato un’ampia casistica (>17.100 pz con AMD avanzata e >60.000 controlli di origine europea e asiatica). Sono stati identificati 19 loci significativamente associati (7 nuovi) che fanno parte della regolazione del complemento, del metabolismo lipidico, del rimodellamento della matrice extracellulare e nell’angiogenesi. L’ereditabilità della AMD è stimata del 45-70%, il contributo di questi 19 geni ne spiega solo una parte (15-65% del totale del contributo genetico per la malattia).

TERAPIA-SPERIMENTAZIONE
Metabolic reprogramming in polycystic kidney disease. Nature Medicine 2013;19:407. News and Views di un articolo (Defective glucose metabolism in polycystic kidney disease identifies a new therapeutic strategy. Nature Medicine Pg. 488)(buona parte degli AA sono del San Raffaele di MI). Le cellule carenti del prodotto del gene PDK1, uno dei due geni che quando mutati sono responsabili del rene policistico autosomico dominante (MIM PDK1 #173900 e PDK2 #613095), hanno un metabolismo riprogrammato per usare la glicolisi aerobica (effetto Warburg)(processo metabolico caratteristico delle cellule cancerose che assumono glucosio a una velocità molto superiore e che utilizzano una frazione minore di quel glucosio per la produzione di energia, meccanismo simile a quello delle cellule fetali) con la partecipazione del pathway mTOR. Nel modello in vitro e in vivo usando un analogo del glucosio che non può essere metabolizzato (2-deossiglucosio) si dimostra un rallentamento della progressione della malattia cistica senza effetti tossici di altri organi. Il commento termina così: “In the future, perhaps manuscripts about PKD will begin with “ADPKD is a neoplastic disorder affecting 12 million people worldwide”.

Rescue of fragile X syndrome phenotypes in Fmr1 KO mice by the small-molecule PAK inhibitor FRAX486.PNAS 2013;110:5671. La s. Fragile X, la più comune malattia ereditaria dell’autismo e del deficit intellettivo, è dovuta al silenziamento del gene FMR1. Il topo KO Fmr1 è un buon modello di questa malattia in quanto manifesta segni simili all’uomo quali iperattività, comportamenti ripetitivi e convulsioni e, dal punto di vista patologico, anomalie di densità e di forma delle spine dendritiche, che sono la sede di connessioni tra i neuroni e strutture critiche per l’apprendimento. Ipotesi: e se riusciamo a correggere le anomalie dendritiche miglioriamo la clinica del topo? Sì.
Come? L’integrità e le funzionalità dendritiche dipendono dalla modulazione dell’actina del citoscheletro e di conseguenza della regolazione delle proteine nel pathway actinico, con il coinvolgimento del patwhay Rac/PAK che dati sperimentali (drosofila) ci dicono che abbia uno stretto rapporto funzionale con il gene Fmr1. In particolare sembra provato che PAK (PAK, proteino chinasi p21-attivata, sono un famiglia -di 6 membri tra cui PAK1- di chinasi attivati in risposta a segnali extracellulari e regolano la motilità e l’aspetto delle cellule) e FMRP siano antagonisti tra loro per regolare il numero e l’aspetto delle spine dendritiche, con l’ipotesi che l’inibizione di PAK comporti la correzione del fenotipo del topo KO Frm1. Almeno questo risulta nel topo e con una strategia genetica. Nel lavoro si prova con una strategia farmacologica usando un potente inibitore di PARK1 che corregge non solo il fenotipo dendritico del topo KO Frm1 ma anche quello comportamentale. E, cosa più importante, in dose unica e nel topo adulto.

Everolimus for astrocytomas in tuberous sclerosis. Lancet 2013;381:1274. Lettera di richiesta di più informazioni sui risultati della terapia con everolimus nella sclerosi tuberosa per il controllo dello sviluppo degli astrocitomi subependimali, che interessano il 5-15% dei pz (Efficacy and safety of everolimus for subependymal giant cell astrocytomas associated with tuberous sclerosis complex (EXIST-1): a multicentre, randomised, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet 2013;381:125)(Articoli interesse Gennaio 2013).
La lettera in particolare sottolinea la necessità di conoscere meglio l’effetto della terapia sull’evoluzione dell’idrocefalia che è una delle frequenti complicazioni dell’astrocitoma.
La risposta sottolinea che l’idrocefalia nel loro studio era un criterio di esclusione e che non è stato poi riscontrato nell’evoluzione dei casi trattati. La risposta conclude con un dato di interesse: la terapia con everolimus ha portato anche alla riduzione degli angiolipomi renali e angiofibromi facciali (vedi sempre nella Selezione del Gen 2013: Everolimus for angiomyolipoma associated with tuberous sclerosis complex or sporadic lymphangioleiomyomatosis (EXIST-2): a multicentre, randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet  2013;381: 817).

TALEN-based Gene Correction for Epidermolysis Bullosa. Molecular Therapy 2 April 2013, | doi:10.1038/mt.2013.56 (non ho il pdf  ma solo l’abstract) commentato da Nature del 2 May 2013 (Enzymes fix disease genes). L’epidermolisi bollosa distrofica recessiva (MIM #226600)(RDEB) è una grave malattia cutanea che dalla nascita comporta  la ricorrenza di vesciche a livello della sub-lamina densa sottostante la membrana basale, che comportano cicatrici mutilanti delle giunture e delle estremità e stenosi gastrointestinali, con il rischio di sviluppare un carcinoma aggressivo delle cellule squamose. Forme alleliche sono la forma dominante con fenotipo meno grave (MIM #131750) e la Distrofia congenita ungueale 8 (MIM #607523), sempre AD, che segregano in una parte di genitori di pz con RDEB. Il difetto molecolare è la carenza di collagene VII codificato da COL7A1.
Viene verificata la possibilità di utilizzare una relativamente nuova tecnica di ingegneria genetica (TALEN)(transcription activator–like effector nucleases) che taglia il DNA in siti specifici con la riparazione che modifica la sede mutata del gene (vedi Genomic cruise missiles. Science 2012;338:1526)(Spigolature Dicembre 2012) nelle cellule di fibroblasti primari di pz con questa malattia. Le cellule del pz così modificate vengono riprogrammate in cellule staminali pluripotenti che hanno una normale espressione proteica e che in vivo mostrano di svolgere l’attività specifica. Quindi un buon modello per la terapia.

ETICA
Committee on Bioethics et al. Ethical and policy issues in genetic testing and screening of children. Pediatrics 2013;131:620) e comment (non ho il pdf)(Technical report: ethical and policy issues in genetic testing and screening of children. Genet. Med. 2013;15:234). Rapporto tecnico sullo screening genetico nei bambini, nei neonati sono per un limitato numero di condizioni e quando l’intervento è efficace. Non per le malattie a insorgenza tardiva. Il rapporto della società di pediatria americana e della società di genetica medica e genomica, sempre americana, è già stato presentato tra gli articoli di Marzo a cui rimando. Il commento di Science del mese scorso (Return of Unexpected DNA Results Urged. Science 2013;339:1507) si dice “scioccato” perché  cozza contro il principio del “non voler sapere”. L’argomento è estremamente interessante e lascia aperto il dibattito.

Anonymity of sperm donors under threat. Nature 2013;496:679. Vedi altre precedenti segnalazioni.
Reale rischio che i donatori di gameti venga individuati nonostante al momento della donazione abbiamo chiesto l’anonimato. Ma risalire al donatore non è stato difficile per il caso pubblicato su Slate il 1 Marzo 2010 da R. Lehmann-Haupt :  …… Fast forward to some years later, when a mother who’d used his sperm to conceive a child saw some troubling autism-like symptoms in her daughter and wondered where they might have come from. She tracked down others who’s used that donor to conceive through the Donor Sibling Registry and connected with several other families whose children has similar symptoms.
That wasn’t enough for her, though, so someone from the group suggested she use a genetic testing service. Because only certain identifying cells are passed to a daughter from a father, and most unique information comes on the Y chromosome passed from father to son, she approached another family to submit a cheek swab. Throught searching the genetic testing company’s website, she found two other families with similar DNA, and from there tracked down her donor. E quindi “Companies selling personal genetic testing therefore have a responsibility to inform customers about the potential risk of privacy breaches, as do clinics accepting gamete donors”.

Preventing Prejudice in Genome Profiling. Science 2013;340:273.  Lettera di commento a una review  “DIAGNOSTIC CANCER genome sequencing and the contribution of germline variants,” special section on Cancer Genomics, 29 March, p. 1559) in cui si sottolinea la rivoluzione della ricerca sul cancro usando le nuove tecnologie genetiche come NGS che consente l’identificazione di una predisposizione a svilupparne una, come prevenirle e come curarle. Questo avanzamento della scienza trascura però la diseguaglianza razziale in USA per l’accesso alle cure con importanti miglioramenti terapeutici che riguardano malattie che colpiscono gruppi con più alto stato socio-economico. Il timore allora è che NGS approfondirà ancor più questo divario promuovendo terapie per determinate classi sociali con mercato più lucrativo. Occorrono interventi di salute pubblica che assicurino equità nella scelta degli obiettivi del mercato farmaceutico globale (pensando alle variazioni genetiche etnia-specifiche questo potrebbe valere anche per patologie genetiche non tumorali, ndr).