Selezione articoli Genetica Clinica/Umana Settembre 2014. R. Tenconi

Scelta di articoli di Genetica Clinica/Umana pubblicati in Settembre 2014 nelle seguenti riviste: British Medical Journal, Lancet, Lancet Neurology, Nature, Nature Biotechnology, Nature Genetics, Nature Medicine, Nature Neuroscience, Nature Reviews Genetics, Nature Reviews Neuroscience, NEJM, PNAS, Science & Cell.

ARTICOLI DA NON PERDERE

Fast sequencing saves newborns. Nature 2014;514:13. Comunicazione dello scorso 19 Set­tembre al meeting Genomics of Common Diseases di Potomac, Maryland sintetizzato così: “Rapid analysis of infant genomes is aiding diagnosis and treatment of inexplicably ill babies”. Sequenziamento ed analisi con diagnosi finale in 24 ore in neonati con patologia grave senza causa apparente, diagnosi che potrebbe condizionare il trattamento, come nel caso presentato con diagnosi in 1 giorno che si è rivelata salva vita, perché con gli attuali tempi di sequenziamento (> 1 mese in USA! Da noi, come si dice, “dipende”, ndr) il b. sarebbe morto. Questo è stato uno dei 28 neonati su 44 neonati utilizzando un approccio multidisciplinare, chiamato “factory approach” (catena di montaggo? ndr), in cui 4 o 5 specialisti svolgono una specifica funzione, dalla clinica, al sequenziamento del DNA, all’analisi informatica focalizzata sulle parti del genoma suggerite dalla clinica (idea non nuova, ma esperienza affascinante, che richiede la buona collaborazione tra vari specialisti, in altre parole un ritorno al futuro). Questo progetto, sequenziamento di neonati con malattie gravi che mettono in pericolo la sua vita, è stato finanziato per verificarne l’efficacia e gli aspetti etici. Vi sono in corso altri progetti in USA di sequenziamento in neonati con patologie o senza alcuna patologia. Ma comunque “everybody is keen to see whether this is the start of a new approach”.

Diagnostic Clinical Genome and Exome Sequencing. NEJM 2014;371:1169. Lettere relative alla review di Leslie Biesecker e Robert Diagnostic Clinical Genome and Exome Sequencing. NEJM 2014;370:2418 (vedi selezione articoli Giugno 2014). La prima fa un buon suggerimento a proposito degli “incidental findings”: andrebbero aggiunte alle 24 malattie (56 geni) rare e trattabili, come raccomandato dall’ACMG,

le malattie genetiche forse meno gravi ma suscettibili di una terapia specifica, soprattutto se prese in fase precoce, come il Diabete m. insulino-dipendente da mutazione HNF1A (MIM #612520) che risponde bene ai derivati della sulfonilurea, la Sitosterolemia (MIM #210250)(xantomi tendinei, aterosclerosi, malattia coronarica da assorbimento eccessivo di steroli vegetali) che risponde egregiamente allo ezetimibe (inibisce l’assorbimento del colesterolo) e a una specifica dieta, la s. Liddle (MIM #177200) che è una forma genetica di pseudo-aldosteronismo trattabile con triamterene (diuretico risparmiatore del potassio, ndr).

L’altra lettera sottolinea il ruolo di Genetic Counselor nell’applicazione dell’esoma clinico.

A questo proposito Leslie G. Biesecker nella sua risposta sottolinea che a prescindere dalla categoria professionale e senza volere enfatizzare il ruolo del genetista clinico “we believe that it would be appropriate for any clinician with the necessary training and skills in genomics to perform these tasks”, anche se poi precisa che in USA pochi medici non genetisti hanno questa preparazione (se ne può discutere in una sede appropriata ma almeno su un punto dobbiamo essere d’accordo: il counseling va fatto dal medico che deve essere ben preparato sull’argomento. I medici che escono dalle nostre scuole di specialità di Genetica Medica hanno la necessaria preparazione genetica e soprattutto per tale counseling? Ndr).

A proposito di Esoma ed Incidental findings nei minori, i professionisti australiani che forniscono consulenza genetica (genetic counselor – GC, e genetisti clinici -CG) interpellati (EJHG 2014;22:1225) tra quali delle quattro seguenti caratteristiche è la motivazione più valida per comunicare un IF (possibilità di prevenzione o terapia, età di comparsa, gravità, probabilità di sviluppare la malattia) hanno risposto: disponibilità di prevenzione e terapia (ndr: personalmente ne avrei messa una quinta: rischio di malattia per altri consanguinei o futuri figli). Con qualche differenza di risposte tra GC e CG, ad es. il coefficiente positivo per possibilità di prevenzione-cura per i GC è simile all’età di comparsa, mentre per i CG la possibilità di prevenzione e cura è nettamente preferita rispetto alle altre.

 

Harmful mutations can fly under the radar. Science 2014;345:1438. Commento (con titolo molto efficace, ndr) di un lavoro (Somatic Mutations in Cerebral Cortical Malformations. NEJM 2014;371:7339 (vedi selezione articoli Agosto 2014) in cui usando un pannello di geni malattia per malformazioni cerebrali con tecnica di sequenziamento ad alta copertura su leucociti di 158 pz con tali anomalie sono state individuate mutazioni considerate patogenetiche in 27 pz (17% con un range dal 10 al 30% per ogni fenotipo). Nel 30% dei casi era presente un mosaicismo somatico, cinque delle 8 mutazioni somatiche erano identificabile con sequenziamento Sanger. Il commento fa un po’ la storia dei mosaicismi, alcuni sono clinicamente facilmente identificabili come tali e, come dice L. G. Biesecker,  “nature is sticking its finger in our eye” (s. McCune-Albright), in altri casi ne è meno facile l’identificazione, come in alcune malattie note come la m. Duchenne, l’emofilia, l’aritmia cardiaca. In altre anche una bassa proporzione di cellule mutate può causare la malattia (sindromi megalencefaliche). Con le attuali tecniche di sequenziamento genomico studiamo in realtà un “average genome” e “mutations that pop up in only a handful of reads will be interpreted as part of the machine’s inherent error rate, rather than as actual differences in DNA sequence between the cells sampled” e per avere maggior probabilità di identificarle dobbiamo “deliberately go looking for them”. E’ quello che hanno fatto nel lavoro commentato usando un sequenziamento ad alta copertura (≥ 200x) e con successo.

Può essere usata un’altra tecnica che mediante PCR individua non tutte le mutazioni di un gene ma solo quella che vogliamo cercare ma con una sensibilità altissima individuando mutazioni presenti in <1% delle cellule. Questo è particolarmente utile per alcune malattie da CNV che in alcune famiglie sembrano de novo e per le quali classicamente usiamo per i genitori il classico rischio di ricorrenza di <1%. Questo ridotto rischio è contestato da un ottimo lavoro (Parent of Origin, Mosaicism, and Recurrence Risk: Probabilistic Modeling Explains the Broken Symmetry of Transmission Genetics. AJHG 2 October 2014;95 in stampa). Anche in base al rischio empirico di ricorrenza per alcune condizioni (vedi Tab. in cui il rischio empirico per l’Acondroplasia è dello 0.2% con un IC 95% da 0.005% a 1.3%, mentre per la m. Duchenne e Becker il RR è dell’8.3% con un IC da 4.8% a 12.2%), gli AA stimano con un modello probabilistico che tale RR da mosaicismo parentale sia più alto e che la differenza di mosaicismo maschio-femmina sia dovuta alla differente gametogenesi che rende ragione della più alta ricorrenza per le malattie XLR. Il commento termina così: A warning for many clinical diagnostic labs: “They’re not realizing they might be missing important stuff”.

 

When disease strikes from nowhere. Nature 2014;513:445. Focalizzazione delle mutazioni de novo come CNV a rischio di patogenicità nell’analisi genomica (secondo i risultati dell’articolo citato sotto nel caso di deficit intellettivo il 60% è dovuto da eventi de novo, 39% SNV e 21% CNV). Molte cose non nuove ma presentate bene. Sappiamo che in ogni neonato sono identificate dalle 60 alle 100 CNV, e solo poche di queste hanno significato clinico. Infatti si stima che dal 20% al 90% (!!) delle de novo all’analisi dell’intero genoma (WGS) possono essere falsi positivi e questo rende l’applicazione clinica di questa tecnica problematica per la necessità dei controlli che richiedono.

Viene sottolineata la necessità di filtrare bene i dati anche sapendo che ci sono dei tratti del genoma proni ad errori di lettura che corrispondono in genere a tratti in cui possono esserci errori di copiatura e di riparazione del DNA. Per questo siamo in grado di identificare solo l’85% delle de novo. Quindi sono necessari vari sistemi di filtraggio per arrivare alla corretta interpretazione dei dati. Comunque ogni piattaforma di sequenza ha le “proprie idiosincrasie” e anche con il miglior software i falsi positivi (de novo) sono il doppio o il triplo dei veri positivi nell’analisi WGS. Da confermare quindi con il Sanger. Altro problema è l’identificazione delle de novo nei tratti non codificanti. Vengono citati i risultati e le difficoltà sorte nello studio di WGS recente di 50 pz con QI <70 (Genome sequencing identifies major causes of severe intellectual disability. Nature 2014;511:344)(selezione articoli Luglio 2014).

Interessante nota: alcuni grossi centri fanno fare il sequenziamento da servizi commerciali e poi l’analisi dei dati la fanno loro (anche questa non è comunque una novità, ed è condivisibile che l’analisi informatica venga fatta a stretto contatto con il medico che ha seguito il pz e richiesto l’esame, ndr). Ultima considerazione (che ripaga tutte le difficoltà che si incontrano, ndr): “these families are very happy to finally get an answer — it often means clo­sure for them, they can give the disorder in their child a place and better accept it”.

A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell 2014;159:200. Confronto dei dati di uno screening dei geni letali del cromosoma X che regolano lo sviluppo, la funzione e il mantenimento del sistema nervosa della Drosofila (che ha 4 paia di cromosomi: X/Y, 1, 2, 3 e 4, ndr)(il 93% dei geni della Drosofila sono conservati nell’uomo) con quelli dell’analisi dell’esoma (WES) di pz (n° 1.929, database BHCMG), con malattie mendeliane del neurosviluppo e senza avere individuato il gene malattia. Identificati nella Drosofila 165 geni di cui non si conoscono gli effetti in vivo. Tra questi vi sono 65 geni conservati non ancora associati a malattie mendeliane con fenotipo neurologico.

L’analisi esomica delle famiglie ha considerato tutte le varianti rare di 237 geni di 1.929 persone. Il confronto ha consentito di individuare in 6 famiglie mutazioni di 3 geni segreganti con la malattia e da considerare patogene. Esaminando l’omologo della Drosofila shibire (shi), il gene che codifica la Dinamina (DNM2), ha portato alla diagnosi in due pz, con quadro clinico non classico della m. Charcot-Marie-Tooh e con mutazione in eterozigosi del gene DNM2 alla diagnosi di m. CMT assonale tipo 2M (MIM #606482). Esaminando uno degli omologhi umani responsabile del fenotipo Drosofila ocelliless (gli ocelli sono gli organi della visione del moscerino)(oc, nell’uomo CRX) sono state trovate in 3 pz con Maculopatia ad occhio di bue (retinopatia lentamente progressiva) mutazioni in eterozigosi di questo gene, il cui prodotto è un fattore di trascrizione omeobox che regola lo sviluppo dei fotorecettori. Dimostrazione di una buona somiglianza fenotipica moscerino-uomo.

Trovata in una famiglia una variante di ANKLE2 segregante con la malattia in 2 pz con grave microcefalia; nel moscerino mutanti Ankle2 hanno gravi difetti di proliferazione dei neuroblasti e eccessiva apoptosi cerebrale nelle larve, letalità ed anomalie di sviluppo che vengono corrette con ANKLE2 umano.

Metodologia da applicare anche per gli autosomi della Drosofila che potrebbe rivelarsi utile nella prioritizzazione delle varianti risultate dall’analisi WES.

MALATTIE NEUROLOGICHE/NEURODEGENERATIVE

Multiple sclerosis in children: an update on clinical diagnosis, therapeutic strategies, and research. Lancet Neurology 2014;13:936. Review sui fattori di rischio genetici ed ambientali per l’evoluzione della sclerosi multipla pediatrica (13-18 anni), sulle novità delle tecniche di neuroimmagini e sulle opzioni terapeutiche, in particolare sugli esiti delle sperimentazioni cliniche pediatriche di questa patologia che colpisce 0.6-1.66 per 100.000 bambini/anno (il 2-10% dei pz con sclerosi multipla). Per i fattori genetici sono in gran parte implicati aplotipi HLA. L’analisi di associazione con GWAS è ostacolata dai piccoli numeri di sclerosi multipla infantile, soprattutto se confrontati con quelli della popolazione adulta; ma alcuni dei loci a rischio identificati per la forma adulta sono ritenuti sufficientemente attendibili anche per la infantile. Sono noti come fattori di rischio, con effetto anche sulla prognosi, carenze di vitamina D, obesità e infezioni pregresse ad agenti come EBV, HSV e altri. Considerandola come una patologia multifattoriale è stato osservato (ma lo studio ha riguardato poche decine di bambini con sindrome demielinizzante acquisita) che la presenza dei tre alleli HLA-DRB15 (uno o due alleli), un sieropositività remota per EBV e bassi livelli di Vit. D erano associati all’esito in sclerosi multipla nel 57% del campione mentre il restante 43% con i tre fattori di rischio rimaneva monofasico (raramente ricorrente). Dei 20 bambini con sindromi demielinizzanti negativi per i tre fattori di rischio solo nel 5% è stato successivamente posta diagnosi di sclerosi multipla.

Clogging information flow in ALS. Science 2014;345:1118. Perspective di due articoli (Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells. Pg. 1139 e

C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins. Pg. 1192) sulla Sclerosi Laterale Amiotrofica. La ALS è una malattia neurodegenerativa grave e rapidamente progressiva, non suscettibile per ora di alcuna cura, con frequenza di 1-2:100,000 ad ogni età. E’ familiare nel 10% dei casi e in questi dei circa 30 geni-malattia quello più frequentemente coinvolto è C9orfF72 con una caratteristica mutazione da espansione esanucleotidica in una regione non codificante (vedi ottima review The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nature Review Neuroscience 2013;14:248 (selezione articoli Aprile 2013). Nei due articoli sopra citati viene ora descritto come le mutazioni del gene C9orf72 possono determinare la neurodegenerazione: i peptidi codificati dall’espansione, soprattutto GR (glicina-arginina) e PR (prolina-arginina), sono tossici ed interferiscono con la formazione di RNA causando la morte cellulare. Questa alterazione dei pathway di processamento dell’RNA è forse lenta all’inizio ma la sua azione prolungata negli anni determina la progressiva perdita dei motoneuroni. Se il principale meccanismo patogenetico è questo potrebbero essere individuate molecole in grado di favorire l’espressione dei dipeptidi meno tossici rispetto ai due sopra riportati.

GENETICA UMANA/CLINICA

Images in Clinical Medicine:

Familial Multiple Lipomatosis. NEJM 2014;371:1237 (1 A italiano). Uomo che dall’età di 3 anni ha sviluppato noduli sottocutanei agli arti e poi al tronco e braccia. A 36 anni almeno 40 noduli indolenti, molli, mobili di diametro mx di 10cm. Lo stesso suo padre e suo fratello. Istologicamente lipomi. DD: malattia Dercum, con accumuli dolorosa di tessuto adipose e malattia Madelung (nulla a che vedere con la deformità Madelung che è costituita da accorciamento di radio e ulna, ndr) con depositi simmetrici di grasso al capo, collo e tronco associato all’alcolismo cronico. La terapia della lipomatosi è chirurgica, se richiesta, ma sapendo che i lipomi possono ricrescere.

Caso clinico che sottolinea il fatto che anche i colleghi internisti devono avere bene in mente le malattie mendeliane:

Case 30-2014: A 29-Year-Old Man with Diarrhea, Nausea, and Weight Loss, NEJM 2014;371:1238. Maschio, 29 anni, in ambulatorio medico per urgenze con nausea e diarrea e perdita di peso da circa 1 anno.

Anamnesi familiare negativa. Serie di esami e visite varie: negativi con l’eccezione di lieve iperbilirubinemia, soprattutto totale, elevati livelli di aminotransferasi, lieve aumento del tempo di protrombina e iperferritinemia, che hanno fatto pensare ad una epatite cronica associata. All’ecoaddome lieve splenomegalia. Dopo qualche settimana feci rossastre, ma non evidenti tracce di sangue. Il gastroenterologo gli fa una esofago-duodenoscopia con biopsie e colonscopia negative ad eccezione di lievi varice esofagee che confermano il sospetto di una patologia epatica. La patologia non sembra acquisita (infezione, alcolica), il test genetico per emocromatosi ereditaria (H63D and C282Y) è negativo, l’α₁-antitripsina è normale. Fatta anche la biopsia epatica. Potrebbe trattarsi di una epatite autoimmunitaria (i criteri diagnostici sono in parte soddisfatti), o una tossicità da farmaci, non nota o la malattia da cui poi è risultato affetto. Ne viene fatta un’ottima diagnosi differenziale con l’epatite autoimmune. Fatta la diagnosi iniziata subito la terapia specifica.

A framework for the interpretation of de novo mutation in human disease. Nature Genetics 2014;46:944. Le mutazione de novo con perdita di funzione genica nelle malattie monogeniche sono molto spesso causali (l’esempio fatto è quello del gene MLL2 nei primi 9 su 10 pz con s. Kabuki). Le cose sono più complicate per le malattie complesse ereditabili come l’autismo (ASD) in cui si trovano con l’analisi esomica mutazioni de novo con perdita di funzione di molti geni ma, con l’eccezione di pochissimi geni, è difficile attribuire alla maggior parte di questi un diretto significato patogenetico per il rilevante differente tasso di mutazione da gene a gene (differente mutabilità) che rende possibile la presenza per effetto del caso di mutazioni dello stesso gene in più pz con la stessa patologia. Per distinguere quanto dovuto al caso o al reale effetto causale della mutazione può essere applicato sui dati del sequenziamento esomico un modello statistico delle mutazioni de novo. Lo studio ha riguardato 1.078 pz con ASD con relativi genitori (trio) e 343 fratelli non affetti. Viene confermata la presenza nel ASD di un eccesso di mutazioni con perdita di funzione e di queste mutazioni in specifici geni. Ma tale eccesso di mutazioni non è presente in pz con ASD con quoziente intellettivo >100, mentre lo è per pz con QI inferiore, dati che confermano una diversa architettura genetica nei pz con ASD in base al QI. Infine il modello ha identificato 1.003 geni (i primi 10 includono RYR2, KMT2A, MLL2  e SYNGAP1) che sono significativamente portatori di mutazioni de novo con perdita di funzione nell’ASD con molti di questi causa di gravi malattie nell’uomo.

A step forward on data sharing and consent. Lancet 2014;384:830. NHI (National Institutes

of Health) americano ha annunciato lo scorso 27 Agosto la decisione di consentire un’ampia e responsabile condivisione dei dati della ricerca genomica da loro finanziata a patto che i ricercatori ottengano dai partecipanti allo studio un chiaro consenso informato in cui si preveda l’uso per la ricerca e la condivisone dei loro dati resi anonimi. In Europa se ne sta discutendo. Alcune organizzazioni non commerciali, come Wellcome Trust ed alcune strutture universitarie, hanno pubblicato lo scorso Luglio una nota sulla protezione dei dati della ricerca prodotti in EU in cui si dichiarano contrari a un consenso specifico per l’uso di dati personali con l’obiettivo di raggiungere un equilibrio tra utilità di usare questi dati e protezione dei diritti e dell’interesse delle persone.

Vedi anche lettera Data protection and consent to biomedical research: a step forward? Lancet 2014;384:855 in cui si esprime un cauto ottimismo di un parziale e ben controllato uso dei dati anche in Europa e uno stimolo ai ricercatori di fare lobby presso le strutture politiche europee.

The genetics of common epilepsies: common or distinct? Lancet Neurology 2o14;13:859. Commento di un articolo dell’ International League Against Epilepsy Consortium on Complex Epilepsies (Genetic determinants of common epilepsies: a meta-analysis of genome-wide association studies. Pg. 893). L’ampio studio di associazione genome-wide riguarda 12 diversi dataset di 3 continenti e di diversi gruppi etnici e il commento pone una questione “filosofica” comune ad altre patologie frequenti e causalmente e clinicamente molto eterogenee: “can genetic factors be identified when the 30 or so different epilepsy syndromes are collapsed together or crudely considered as generalised (2.600 casi) or focal types (5.300 casi)? Risultati: SNP di SCN1A, gene-malattia noto di alcune epilessie rare, come la s. Dravet, sono risultati significativamente associati nel caso di epilessia generalizzata, focale o non classificata. Sono stati identificati 2 nuovi candidati, uno per tutte le epilessie in 4p15.1 (possibilmente coinvolgente una protocaderina, PCDH7) e un secondo per l’epilessia generalizzata in 2p16.1. Quindi i risultati sono

particolarmente interessanti per l’epilessia generalizzata. Ma rimane il limite dell’eterogeneità, che è il prezzo da pagare in studi come quelli che utilizzano GWAS o quando si applicano meta-analisi.

Il commento prosegue indicando come questi studi possano essere più significativi ricorrendo a una migliore classificazione della patologia (endofenotipi che sono marker interni intermedio tra gene e fenotipo), ipotesi di lavoro, pathway comuni (vedi ad es. Multivariate analysis reveals genetic associations of the resting default mode network in psychotic bipolar disorder and schizophrenia. PNAS 2014;111:E2066)(articoli Maggio 2014). Un cambio di strategia (focalizzare bene i fenotipi) unitamente ad approcci metodologici diversi come le varie omiche, incluso l’epigenoma, potrà consentire di precisare per il singolo pz la presentazione clinica, la comorbilità e la prognosi di queste patologie.

SnapShot 1: FMRP mRNA Targets and Diseases. Cell 2014;58:1446.e1 (AA italiani). Come noto l’assenza o la mutazione della proteina FMRP, codificata da FMR1, causa la sindrome Fragile X (FXS). FMRP lega mRNA (è una RNA binding protein) e regola la traduzione, il trasporto e la stabilità di molte proteine che sono i suoi bersagli (regulone FMRP, cioè l’insieme di geni sotto il controllo della stessa proteina regolatrice, ndr). E’ prevedibile che proprio la sregolazione di mRNA bersaglio causi il fenotipo FXS (probabilmente non solo di un mRNA) e quindi è opportuno conoscere quali sono e la funzione della relativa proteina. Molti mRNA sono legati a malattie neurologiche con segni compatibili con il fenotipo della sindrome (autismo, schizofrenia, depressione). Sono infatti coinvolti vari aspetti tipici delle malattie neurologiche come l’attività sinaptica, l’adesione cellulare e la stabilità del citoscheletro. Ma alcuni target di FMRP sono coinvolti anche in malattie non neurologiche facendo sospettare che FMRP abbia un ruolo anche in altre malattie. Bella tabella con l’intero regulone (più di 40 geni) con specificato il nome del gene e della proteina, la funzione molecolare, n° OMIM e la relativa malattia (11 di questi coinvolti nel cancro, tra cui APC).

SnapShot 2: FMRP Interacting proteins. Cell 2014;158:218.e1 (stessi AA). FMRP ha 4 domini leganti RNA necessari per il riconoscimento di mRNA target che interagiscono anche con una serie di proteine che svolgono diverse funzioni cellulari. Molte proteine interagenti con FMRP sono proteine citoplasmatiche leganti RNA (RBP) coinvolte nei processi cellulari del metabolismo del mRNA, assemblaggio ribosomico e spliceosomico, soppressione della traduzione o alterazione della struttura secondaria del RNA. Altre agiscono nel nucleo dove sono coinvolte nella trascrizione, splicing e riparazione del DNA e alcune di queste proteine hanno funzioni extranucleari e sono parte del complesso dei granuli mRNA. A livello sinaptico FMRP interagisce con componenti dei pathway di segnale come recettori, chinasi e fosfatasi.

E, tramite il suo interattore CYFIPI, partecipa al rimodellamento del citoscheletro actinico. Bella tabella delle proteine interagenti, con geni classificati in base alla loro funzione (nucleare, traduzione, trasporto e rimodellamento del citoscheletro).

Rare variants in PPARG with decreased activity in adipocyte differentiation are associated with increased risk of type 2 diabetes. PNAS 2014;111:13127. Una variante comune non sinonima del gene PPARG (peroxisome proliferator-activated receptor gamma), che è un regolatore trascrizionale della differenziazione adipocitica e bersaglio di farmaci antidiabetici tiazolididedioni (farmaci in grado di aumentare la sensibilità all'insulina nei tessuti, ndr), comporta un ridotto, anche se modesto (20%) rischio di T2D. In rare famiglie mutazioni con perdita di funzione di PPARG, che causano in vitro il blocco della differenziazione adipocitica  sono causa di una sindrome con lipodistrofia, insulino resistenza e T2D. Non è noto il contributo di queste mutazioni nel causare una comune malattia come T2D e il ruolo della differenziazione adipocitica nella malattia. Il sequenziamento di quasi 20.000 pz con T2D (n° 9.070) e controlli multietnici ha consentito di identificare 49 mutazioni di questo gene che alterano la proteina e di caratterizzare in vitro la loro funzione a livello cellulare. Tra queste 9, classificabili come mutazioni con perdita di funzione, comportano un rischio aumentato (di sette volte)(OR = 7.22; P = 0.005) di T2D, mentre quelle classificate come benigne non incrementano di rischio di T2D. Dal punto di vista di popolazione 1 persona su 1.000 è portatrice di una variante di PPARG che riduce la differenziazione adipocitica e che è associata a T2D.

Vedi anche sullo stesso fascicolo:

Ghrelin promotes hepatic lipogenesis by activation of mTOR-PPARγ signaling pathway. PNAS 2014;111:13163. mTOR e PPARG sono il pathway di segnale come target intracellulare della Grelina (ormone che stimola l’appetito) negli epatociti.

 

Focus su (Nature Biotechnology September 2014) on RNA sequencing quality control (SEQC). L’RNA, soprattutto dopo l’introduzione delle tecniche di sequenziamento, è un ottimo candidato per il monitoraggio e la diagnosi di malattia. Ma occorre che vengano preparati ed adottati metodi standard di analisi e vengano accumulati dati per determinarne l’accuratezza analitica e la riproducibilità. A questo è dedicata la nota e gli articoli sottoelencati.

Bringing RNA-seq closer to the clinic. Nature Biotechnology 2014;32:884.

Detecting and correcting systematic variation in large-scale RNA sequencing data. Pg 888

Normalization of RNA-seq data using factor analysis of control genes or samples. Pg. 896.

A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Pg 903.

Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the ABRF next-generation sequencing study. Pg. 915.

The concordance between RNA-seq and microarray data depends on chemical treatment and transcript abundance. Pg. 926.

Check but verify. Nature Genetics 2014;46:927. Prendendo spunto dai risultati di uno studio di associazione genome wide mediante GWAS (Joint analysis of three genome-wide association studies of esophageal squamous cell carcinoma in Chinese populations. Pg 1001) l’editoriale sottolinea, per evitare errori di rilevazione e di interpretazione, la necessità di rendere accessibile in un database ad accesso controllato i dati genetici e fenotipici a livello individuale per eventuale rianalisi dei dati. Come il database dei genotipi e dei fenotipi dbGaP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gap; doi:10.1038/) o l’archivio europeo Genoma-fenoma EGA (https://www.ebi.ac.uk/ega/) o altri sistemi.

Nell’articolo, sempre sullo stesso fascicolo, viene riportata l’esperienza di 7 anni dell’archivio dbGaP (Data use under the NIH GWAS Data Sharing Policy and future directions. Pg. 934) in cui, oltre a presentare l’esperienza e gli sviluppi di questa condivisone dei dati, si riportano esperienze di successo nel riuso dei dati per la ricerca.

JAGN1 deficiency causes aberrant myeloid cell homeostasis and congenital neutropenia. Nature Genetics 2014;46:1021. La neutropenia congenita grave (SCN) comporta infezioni batteriche che possono causare la morte del pz. Sono noti vari geni di SCN: ELANE (SCN1 60% dei casi)(#MIM 202700), G6PC3 (SCN4)(MIM #612541), HAX1 (SCN3)(MIM #610738). E geni del sistema endosoma (l’endocitosi è il meccanismo cellulare che permette il transito attraverso la membrana di macromolecole e corpuscoli)-lisosoma (che degrada e distrugge le macromolecole estranee entrate per endocitosi) associati alla SCN: AP3B1 (sindrome Hermansky-Pudlak 2, MIM #608233), LAMTOR2 (Immunodeficienza da difetto di MAPBP-interacting protein, MIM #610768), VPS13B (sindrome Cohen, MIM #216550), VPS45 (SCN5)(MIM #615285). Altri geni sono GFI1 (SCN2)(MIM #613107) e WAS (s. Wiskott-Aldrich)(MIM #301000).

L’analisi di linkage con SNP e controllo con Sanger e poi dell’esoma, di 2 famiglie sefardite (ebrei provenienti dalla Spagna) di consanguinei con più affetti e tra loro con cognome comune (ma non è stata riconosciuta una stretta consanguineità tra queste due famiglie) ha identificato una mutazione in omozigosi del gene JAGN1. Sono state allora cercate mutazioni di questo gene in altri 74 pz e in 9 (di 8 famiglie) sono state trovate mutazioni in omozigosi, in gran parte missenso e in un pz nonsenso.

Clinicamente si tratta di SCN non sindromica con fenotipo simile a quello dovuto a mutazioni di ELANE o HAX1 non sindromiche, ma con occasionali anomalie osteo-articolari (bassa statura, LCA, scoliosi, osteoporosi, amelogenesi imperfetta), malformazioni dei denti, insufficienza pancreatica e lieve deficit cognitivo (altri geni causa data la consanguineità? Ndr) e anche considerevole variabilità clinica nella stessa famiglia. Di interesse: modesta risposta nei pz al ricombinante del fattore stimolante le colonie dei granulociti. Il gene JAGN1, proteina del reticolo endoplasmatico che svolge una funzione del pathway secretorio in uno stadio precoce, è quindi un fattore critico per la differenziazione e il mantenimento dei neutrofili nell’uomo.

Single cell sequencing reveals low levels of aneuploidy across mammalian tissues. PNAS 2014;111:13409. L’aneuploidia è un’anomalia del numero di copie di DNA di un intero cromosoma che ha come effetto quello di alterare l’espressione e la dose dei relativi geni, con effetti fenotipici dipendenti dal fatto se è somatica o costituzionale (vedi bellissima review selezionata negli Articoli di interesse Gennaio 2013: Gene Copy-Number Alterations: A Cost-Benefit Analysis. Cell 2013;152:394). Per l’effetto fenotipico che l’aneuploidia comporta è sorprendente quanto riportato in alcuni studi di frequenti aneuplodie nel fegato e nel SNC usando tecniche quali la FISH e SKY (tecniche con possibili artefatti che portano alla sovrastima di aneuploidia), il che potrebbe far pensare che non solo non ne sonio compromesse la funzione ma addirittura un vantaggio per la plasticità fenotipica. Per verificare tale paradosso si è sequenziato l’intero genoma della singola cellula per identificare CNA in tessuti di topo e dell’uomo. Nell’uomo l’aneuploida nella cute è bassa (IC 95% 0-6.7%), analogamente bassa nei neuroni di topo; nella materia grigia frontale dell’uomo (all’autopsia di persone senza malattie neurologiche) la prevalenza è stata del 2.2% (95% IC 0.3%–7.9%), ben diversa da >20% negli studi precedenti. Nel fegato di topo la maggioranza degli epatociti era tetraploide, nell’uomo la ploidia variava da diploidia a octaploidia, con maggior frequenza e con analoga proporzione di diploidia e tetraploidia. Questo ha comportato difficoltà di lettura che ha richiesto controlli interni. Nel topo non sono state osservate aneuploidie, nell’uomo <5%.

In sintesi le aneuploidie nell’uomo (e nel topo) sono poco frequenti e l’ipotesi di un vantaggio funzionale non provata.

Mitochondrial reactive oxygen species are scavenged by Cockayne syndrome B protein in human fibroblasts without nuclear DNA damage. PNAS 2014;111:13487. La s. Cockayne è una malattia da difetto di riparazione del DNA che coinvolge la riparazione accoppiata alla trascrizione (Transcription Coupled Repair, TCR):  CSA corrispondente alla s. Cockayne A (MIM #216400)(20% dei pz Cockayne, ndr), CSB corrispondente alla s. Cockayne B (MIM#133540)(80% dei pz Cockayne, ndr) e UVSSA corrispondente alla Ipersensibilità ai raggi UV (MIM #614640). Tutti e tre intervengono sull’enzima RNA polimerasi II, bloccato nella sua progressione sull'elica trascritta del DNA danneggiato, favorendone l'accesso e la stabilità dei fattori deputati alla riparazione di tale danno e quindi la ripresa della trascrizione. Mutazioni di uno di questi geni causa l’ipersensibilità agli UV, ma nella s. Cockayne, a differenza della UVSSA, vi è, oltre ad altri segni clinici, una grave patologia neurologica. Nelle cellule di pz con Cockayne B, e non di pz con UVSSA, vi sono alti livelli di radicali liberi dell’ossigeno (specie reattive dell’ossigeno –ROS) nei mitocondri specialmente quando è inibito dal rotenone il complesso I mitocondriale. L’aumento di ROS determina uno stress ossidativo cellulare, ma senza danno del DNA. Il che fa pensare che la neurodegenerazione sia dovuta alla patologia mitocondriale più che al danno di riparo del DNA.

Unpacking the Unfolded Protein Response. Cell 2014;158:1221. Leading Edge che annuncia che nel 2014 Albert Lasker Basic Medical Research Award è stato vinto da due ricercatori che hanno identificato

i meccanismi molecolari della risposta cellulare al malripiegamento di proteine, meccanismo che è una sorta di controllo di qualità che identifica queste proteine dannose per la cellula nel reticolo endoplasmatico (RE) e che segnala al nucleo di prendere misure correttive. In questo articolo se ne spiega il funzionamento (l’accumulo di proteine malripiegate nel RE è il meccanismo patogenetico di una lunga serie di malattie che vanno dal cancro, al diabete, alle malattie autoimmuni, malattie epatiche, obesità e neurodegenerative).

Mutation has big disease effect. Nature 2014;513:463. Commento di un articolo dei risultati di una ricerca (A rare variant in APOC3 is associated with plasma triglyceride and VLDL levels in Europeans. Nature Communications 2014;5:4871)(alcuni AA italiani) di sequenziamento genomico di più di 3.000 europei con noti livelli di trigliceridi, i cui alti livelli sono associati a rischio di malattia cardiaca. In meno dello 0.2% dei partecipanti una variante del gene APOC3 è associata a ridotti livelli di trigliceridi tali da ridurre per il portatore il livello di rischio di patologia cardiaca. Questo studio è anche uno stimolo per sequenziare ampie popolazioni per trovare varianti genetiche che hanno un considerevole impatto sul rischio di malattia.

Protecting human research participants in the age of big data. PNAS 2014;111:13675. Editoriale su Proposed revision to the “Common Rule” for the protection of Human Subjects in the Behavioral and Social Sciences da parte del National Research Council of the National Academies (2014).

Autoimmunity by haploinsufficiency. Science 2014;345;1560. Commento di una nuova condizione da deficit immunitario per aploinsufficienza del gene CTLA4 (Immune dysregulation in human

subjects with heterozygous germline mutations in CTLA4. Pg. 1623). Notevoli progressi per la genetica delle malattie autoimmunitarie mendeliane rare e clinicamente omogenee. Minori progressi invece dagli studi di associazione genome-wide per condizioni comuni e clinicamente meno omogenee. Sinora sono state individuate e caratterizzate 3 malattie autoimmunitarie monogeniche: s. Poliendocrinopatia autoimmune tipo 1 (MIM #240300), l’Enteropatia immunoproliferativa XL (MIM #304790) e la s. Linfoproliferativa autoimmune (MIM #601859). Sono state individuate 4 famiglie con un quadro clinico complesso caratterizzato da infiltrazione di vari organi non linfoidi (intestino, polmoni, encefalo) di cellule T e B iperattive oltre ai comuni segni di autoimmunità. L’analisi WES in una famiglia ha individuato in una famiglia con due affetti una mutazione in eterozigosi nonsenso del gene CTLA4 (cytotoxic T lymphocyte antigen 4) e l’analisi del gene in altre 3 famiglie (in una più affetti in tre generazioni) ha confermato che l’aploinsufficienza di questo gene causa la malattia ma non ha completa penetranza (interessanti le considerazioni generali del “Commento” sul perché di questo fenomeno).

Nel Commento infine un’utile tabella in cui si elencano i 14 errori congeniti dell’immunità a trasmissione AD, di cui solo due con penetranza completa (uno di questi la s. CHARGE da mutazione CHD7 che comporta una immunodeficienza delle cellule T).

Si è osservato che l’uso di anticorpi anti CTLA4 nel trattamento del melanoma comporta anomalie istopatologiche intestinali simili a quelle osservate in alcuni di questi pz. E nel lavoro si dimostra che il trattamento con una mimetico CTLA4 (CTLA4–Ig) riduce in vitro la linfoproliferazione delle cellule T di un pz. Una proposta terapeutica per la s. da aploinsufficienza CTLA4.

A proposito di screening di popolazione:

Population-based screening for breast and ovarian cancer risk due to BRCA1 and BRCA2. PNAS 2014;111:14205. Mutazioni dei geni BRCA1 e BRCA2 comportano un alto rischio al cancro mammario e ovarico, la cui morbilità e mortalità può essere considerevolmente ridotta con interventi chirurgici preventivi. Ma molte portatrici di mutazione sono riconosciute tali dopo la diagnosi di cancro perché avevano un’anamnesi familiare negativa per tale patologia. Quindi si pone la questione della opportunità di screening genetico di popolazione femminile giovane, ma per poterlo applicare è necessario conoscere il rischio di cancro per ogni mutazione dato che oggi sappiamo solo quello derivato dagli studi familiari.

In questo studio di popolazione sulla predisposizione al cancro mammario e ovarico nella popolazione ebraica askenazita (originari dell’Europa centrale ed orientale) sono state cercate 3 mutazioni (2 del BRCA1 e 1 del BRCA2) che da sole sono causa dell’11% del cancro mammario e del 40% del cancro ovarico e che costituiscono la quasi totalità dei tumori mammari ereditari dovuti ai due geni. Risultati: in metà delle famiglie con una di queste mutazioni l’anamnesi è negativa. E’ stato stimato il rischio cumulativo di sviluppare uno cancro mammario e ovarico per età (a 60 anni 0.60, per donne con mutazioni di BRCA1 e 0.33 per mutazione di BRCA2), con un incremento di rischio aumentato per le donne nate dopo il 1958, forse per una migliore applicazione dello screening o anche per fattori ambientali non noti.

Questo pone la questione generale dell’utilità degli screening genetici di popolazione (argomento molto dibattuto per le difficoltà talora di previsione clinica, ndr). 

Retraction challenges. Nature 2014;514:5. “Cleaning up the literature can be difficult”, ma rimane un pressante dovere da parte degli editori ritrattare un lavoro con dati falsificati superando vari e non indifferenti ostacoli tra i quali eventuali azioni legali degli AA che vedono perdere la loro reputazione.

MEDICINA RIGENERATIVA/CELLULE STAMINALI

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Investigating human disease using stem cell models. Nature Reviews Genetics 2014;15:625. Le cellule staminali di pazienti sono un buon modello per studiarne la malattia per capirne la patogenesi, identificare biomarcatori e sperimentare eventuali terapie farmacologiche o di trapianto cellulare. In questa review vengono presentate le varie metodologie (bella la Fig. 1 da usare a lezione, ndr) ed applicazioni.

Le cellule staminali adulte, utili per studiare i meccanismi patogenetici pz specifici di alcune malattie soprattutto quelle neurologiche e in questo caso le staminali neurali, hanno dei limiti nella loro ridotta espansione cellulare e il ridotto potenziale di differenziazione (quasi esclusivamente gliale). Meglio funzionano le cellule staminali embrionali umane (ESC) con cui sono stati creati modelli per la s. FragileX e la m. Huntington, ma che richiedono la diagnosi genetica preimpianto (oltre alla questione etica per il loro utilizzo, ndr). Alternativamente le ESC vengono co-coltivate con cellule umane con il fenotipo della malattia di cui si vuole ottenere il modello cellulare o, infine, ricorrere alle ESC applicando uno specifico gene editing. Un buon modello delle malattie mendeliane è stato ottenuto ricorrendo alle cellule staminali totipotenti indotte (iPSC) da cellule somatiche per le malattie neurodegenerative (vedi ad es. il lavoro sulla m. Kennedy in questa selezione), le cardiache (QT lungo), con interessamento epatico (m. Wilson)(elencate 24 malattie in Tab. 1). La tecnica di gene editing (ottimo il Box che spiega la tecnica) è stata applicata su iPSC di pz con malattie mendeliane, come la beta-talassemia per correggerne il difetto (selezione articoli Agosto 2014 CRISPR/Cas9 and piggyBac. Genome Research Published in Advance August 5, 2014 http://doi.org/t3v 2014) o per capirne la patogenesi.

Le iPSC sono considerate come un formidabile e promettente strumento per scoprire nuovi farmaci o per testarne l’efficacia o la tossicità.

Ecco un ottimo esempio di efficacia:

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Statins give bone growth a boost. Nature 2014;513:494. Commento dell’articolo (Statin treatment rescues FGFR3 skeletal dysplasia phenotypes. Nature 2014;513:507) sulla possibile terapia con statine per malattie da mutazione con acquisizione di funzione del gene FGFR3, come l’Acondroplasia (ACH) e la Displasia Tanatofora 1 (TD1). Il gene controlla, frenando, la macchina molecolare che regola la crescita delle ossa degli arti durante l’infanzia e l’adolescenza. Quando mutazioni di questo gene ne causa una sopraregolazione “brake too hard” la crescita ossea. In queste malattie infatti i difetti scheletrici sono dovuti alla ridotta proliferazione e alterata maturazione delle cellule che formano la cartilagine (condrociti) nelle regioni di accrescimento dello scheletro. Nel lavoro, dice il commento, si è fatto un considerevole passo in avanti nella strategia di trovare farmaci potenziali per la crescita scheletrica tramite un sistema basato sulla malattia umana. Sono infatti state preparati modelli di cellule staminali totipotenti indotte (iPSC) da fibroblasti di pazienti con ACH e TD1 e relativi modelli murini. In coltura di cellule con la mutazione riducendo i livelli di FGFR3 si normalizza la formazione della cartilagine. Gli AA hanno usato queste colture per testare molte molecole e hanno trovato che svolgevano tale effetto sia il peptide natriuretico C (CNP) che le statine (incluse la lovostatina e la rosuvastatina già in commercio per l’ipercolesterolemia anche in età pediatrica). CNP ha lo svantaggio di richiedere iniezioni giornaliere perché è degradato in pochi minuti; una molecola più stabile è in sperimentazione clinica per pz con ACH, ma sembra che abbia effetti collaterali cardiovascolari e del SNC e quindi non particolarmente consigliabile per terapie di lungo termine. Per le statine (rosuvastatina) oltre all’effetto in vitro si dimostra anche un parziale effetto in vivo nel modello murino di ACH sulla crescita degli arti e del cranio probabilmente tramite un meccanismo di degradazione della proteina FGFR3. Si pensa che tale meccanismo sia dovuto alla riduzione del colesterolo cellulare che destabilizza le membrane cellulari in modo tale che FGFR2 che attraversa la membrana sia più facilmente portato all’interno e degradato. Un’osservazione interessante perché si sa che nella ACH la mortalità per patologia cardiaca è molto più frequente (>x10 volte) di quella della popolazione generale; non se ne conosce la causa che potrebbe allora essere correlata con gli alti livelli di colesterolo osservati in questi pz.

E un possibile trattamento con farmaci off label?

Japanese woman is first recipient of next-generation stem cells. Nature 12 Sept 2014; 10.1038/nature.2014.15915. Prima sperimentazione clinica con uso di cellule staminali totipotenti indotte (iPS) derivate dal pz stesso: primo pz con degenerazione maculare età dipendente che ha ricevuto un trapianto di iPS differenziate in cellule retiniche (ovviando ai problemi etici che comporta l’uso delle cellule embrionali umani). L’intervento è avvenuto 4 giorni dopo l’autorizzazione della commissione ministeriale giapponese. Questa sperimentazione, dice il commento, difficilmente restituirà la vista al pz stesso ma servirà per valutare se l’intervento sarà in grado di bloccare l’evoluzione degenerativa della retina e se compariranno effetti collaterali (immunitari, tumori o altro).

MODELLI ANIMALI E PROPOSTE TERAPEUTICHE

Neuregulin-1 alleviates Charcot-Marie-Tooth disease in rats. Nature Medicine 2014;20:984. Commento di un articolo (Soluble neuregulin-1 modulates disease pathogenesis in rodent models of Charcot-Marie-Tooth disease 1A. Pg. 1005 su una possibile cura per la m. Charcot-Marie-Tooth, polineuropatia degenerativa motorio-sensitiva con interessamento del sistema neurologico periferico a lenta progressione per la quale non c’è cura. Vi è una progressiva demielinizzazione e la debolezza muscolare e la ridotta sensibilità sono in rapporto al grado di perdita assonale. E’ dovuta ad una duplicazione del gene PMP22 codificante una proteina della mielina compatta, ma non ne è ben chiaro il meccanismo patogenetico. Nel lavoro su un modello animale (ratto) viene chiarito in parte il meccanismo molecolare causa della perdita assonale e suggerita una possibile terapia. La duplicazione di Pmp22 provoca una sdifferenziazione delle cellule della mielina (cellule Schwann) con una ridotta attivazione del pathway P13K-Akt e un’aumentata attivazione del pathway MEK-ERK nei nervi periferici, mentre al contrario nell’animale con solo una copia di Pmp22 vi è un’aumentata attivazione di P13K-Akt. Sempre nei ratti con l’uso di farmaci inibitori di MEK-ERK in vitro (cellule Schwann) e in vivo (nel nervo sciatico) si nota la riduzione dei marcatori dei marcatori della sdifferenziazione. Quindi il meccanismo patogenetico della CMT1A sembra essere un’alterata regolazione tra questi due pathway. Gli AA hanno verificato l’effetto di un attivatore del segnale PI3K-AKT, la neuregulina-1 (NRG1), prima ricorrendo ad incroci di ratti CMT1A e ratti transgenici che sovraesprimono Nrg1 solubile e provando che nell’animale con la doppia mutazione è aumentata l’attivazione del pathway associata ad un normale fenotipo assonico. Poi iniettando NRG1 umano nei ratti CMT1A in età precoce (da P6 a P18) con netto effetto positivo sull’aspetto e funzionalità assonale e sulla sintomatologia a lungo termine (almeno sino a P90). Da notare che tale effetto terapeutico si verifica solo se NRG1 è somministrato precocemente e da sottolineare però che NRG1, ligando dei recettori HER/erbB, ha potenzialmente effetti neoplastici.

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Activating internal ribosome entry to treat Duchenne muscular dystrophy. Nature Medicine 2014;20:987. Commenti di un lavoro (Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice. Pg. 992)(molti AA italiani) su una nuova prospettiva terapeutica per la m. Duchenne, dovuta all’assenza della distrofina che è una proteina intracellulare strutturale del muscolo essenziale per la connessione tra citoscheletro interno e membrana basale extracellulare. Il rapporto genotipo-fenotipo segue la regola del “reading frame”, che dice che la gravità è riconducibile al fatto che la mutazione nella traduzione causi o meno lo sfasamento della cornice di lettura dell’mRNA, cioè nessuna produzione proteica (Duchenne, fenotipo grave) o una certa produzione proteica (Becker MD, fenotipo lieve). Le sperimentazioni cliniche in corso consistono nel normalizzare la cornice di lettura tramite uno skipping esonico dove c’è la mutazione con produzione di una proteina tronca e quindi un fenotipo simil- Becker (Vedi selezione articoli Set 2013)( Doubts raised over ‘read-through’ Duchenne drug mechanism. Nature Biotechnology 2013;31:771). Mutazioni nell’esone 1 o 2 del gene DMD danno un fenotipo molto lieve in quanto la traduzione inizia all’esone 6, la proteina è tronca (manca degli aminoacidi codificati degli esone 1-5) ma funzionante. Nel lavoro si dimostra, sulla base di 2 pz con una mutazione (delezione e frameshift) dell’esone 2 con fenotipo lieve, che l’iniziazione della traduzione dall’esone 6 del gene DMD è diretta da un sito interno per l’ingresso ribosomico (IRES) nell’esone 5.

In un altro pz con duplicazione dell’esone 2, che causa una proteina molto corta non funzionante e fenotipo grave, si dimostra in vitro che IRES nell’esone 5 non funziona (spiegando quindi la gravità) e che può essere attivato, come dimostrato nel modello animale, da una delezione dell’esone 2.

Questa potrebbe essere una strada per la terapia nei pz con mutazioni nei primi 5 esoni, in particolare quel 6% dei pz con duplicazione dell’esone 2.

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p53 and CHARGE syndrome. Nature Medicine 2014;20:991. Commento di un articolo (Inappropriate p53 activation during development induces features of CHARGE syndrome. Nature 2014 Aug 3: doi:10.1038/nature13585) sull’inappropriata attivazione di p53 (gene soppressore di tumore) nel determinare il fenotipo della sindrome malformativa CHARGE. E’ un sindrome malformativa con ampio quadro clinico con anomalie dell’orecchio esterno ed interno (del padiglione auricolare, ipoplasia dei canali semicircolari, ipoacusia), oculari (coloboma, microftalmia), delle coane (atresia), iposmia e paralisi facciale, facciali (schisi), cardiache, genito-urinarie e altre oltre a deficit di crescita ed intellettivo. Nel 70-90% dei casi è presente una mutazione del gene CHD7 che codifica un rimodellatore della cromatina ATP-dipendente, ma non si sa come questo causi il complesso fenotipo. Nei topi una mutazione knock-in (inserzione di sequenza in locus specifico) di p53 che esprime una proteina stabilizzata trascrizionalmente inattiva in presenza dell’allele selvatico causa una letalità embrionale tardiva con fenotipo che richiama molto quella della sindrome. Il meccanismo patogenetico è costituito da un’iperattivazione dell’allele selvatico che agisce in modo eccessivo sui suoi geni bersaglio provocando arresto del ciclo cellulare o apoptosi durante il delicato periodo dello sviluppo. Nel lavoro si dimostra che CHD7 lega il promotore di p53 regolandone negativamente l’espressione e che la perdita di CHD7 nelle cellule della cresta neurale di topi e nei fibroblasti di pz con CHARGE è responsabile dell’attivazione di p53.

Infine l’eterozigosità di p53 attenua il fenotipo degli embrioni di topo che mancano di Chd7 (topi nulli) confermando il ruolo di p53 sul fenotipo in presenza di difetto di CHD7. E’ probabile, concludono gli AA,  che il 10-30% dei pz CHARGE CHD7 negativi abbia una mutazione di geni del pathway p53 (ma l’analisi di sequenza di p53 in 25 di questi pz non ha mostrato alcuna mutazione di questo gene).

Un ulteriore stimolo per la ricerca: data la sovrapposizione fenotipica tra CHARGE e sindrome da delezione 22q11.2, anche per questa sindrome potrebbe essere coinvolto p53 nel concorrere a determinarne il quadro clinico.

Ancora il ruolo di p53 nella delezione 22q11.2.

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p53 suppression partially rescues the mutant phenotype in mouse models of DiGeorge syndrome. PNAS 2014;111:13385. Due AA italiani che da anni fanno ricerca su questa patologia. Il gene TBX1 è uno dei vari geni nel segmento deleto un 22q11.2 di questa sindrome, ma mutazioni in eterozigosi di questo gene sono sufficienti per spiegarne buona parte del fenotipo. Alcuni segni clinici sono difetti di sviluppo (malf. cardiovascolari, a-displasia timica, difetti palatini), ma altri, come la frequente (60% dei pz, ndr) patologia psichiatrica (schizofrenia, disturbo bipolare, crisi di ansia), compaiono nell’adolescenza o in età adulta e potrebbero essere suscettibili di prevenzione-trattamento. Sono state ricercate strategie per ovviare all’aploinsufficienza di Tbx-1 nel modello animale (topo). E stato individuato un gene, Trp53 (p53), che condivide con Tbx-1 un target (sono ambedue fattori di trascrizione) rappresentato da Gbx2, il cui prodotto è richiesto per lo sviluppo cardiovascolare. Embrioni di topo con la doppia delezione (Tbx1^+/−;Trp53^+/−) hanno un normale sviluppo cardiovascolare. In presenza di delezione di Tbx-1 Gbx2 è sottoregolato, ma la sua espressione si normalizza in presenza di delezione anche di Trp53 tramite una riduzione di marcatori cromatinici repressivi del gene Gbx2. Questi risultati, oltre ad individuare un ruolo della proteina p53 nella morfogenesi cardiaca (da sottolineare che mutazioni rare di Trp53 sembrano far parte dell’eredità multigenica della Tetralogia Fallot (Hum Mol Genet 2014;23:3115)), dimostrano che il fenotipo (almeno quello cardiovascolare, ndr) da delezione di Tbx-1, può essere corretto con la riduzione di espressione di Trp53, geneticamente o farmacologicamente.

Per i depressi (*** per la frequenza):

Skeletal Muscle PGC-1α1 Modulates Kynurenine Metabolism and Mediates Resilience to Stress-Induced Depression. Cell 2014;159:33. Non si sa perché l’attività fisica faccia bene ai depressi, patologia molto comune che coinvolge milioni di persone in tutto il mondo. In questo articolo ricorrendo al topo transgenico sottoposto (poverino, anche lui, ndr) a stress cronico si rileva che l’effetto dell’esercizio sull’umore è mediato da alterazioni del pathway chinureninico della degradazione del triptofano nel muscolo scheletrico. L’esercizio fisico favorisce la conversione della chinurenina ad acido chinurenico, che è un metabolita che non può attraversare la barriera emato-encefalica, riducendo il carico chinurenico a livello cerebrale e proteggendolo dalle alterazioni indotte dallo stress che sono associate alla depressione.

Quindi una possibilità terapeutica della depressione con farmaci che agiscono sull’asse PGC-1α1 (pronounced PGC-1alpha1)/PPARα/δ (recettori della proliferazione perossisomiale) a livello del muscolo scheletrico senza la necessità di attraversare la barriera emato-encefalica (e semplicemente uscendo e muovendosi ogni giorno contrastando la voglia di chiudersi in casa, ndr).

Loss of BMAL1 in ovarian steroidogenic cells results in implantation failure in female mice. PNAS 2014;111:14295. I ritmi circadiani sono stati chiamati in causa in una serie di patologie tra cui cancro, diabete e anche infertilità. E’ nota una proteina, BMAL1 (brain muscle arnt-like 1) che in un complesso dimerico con la proteina CLOCK  fa funzionare l’”orologio molecolare” che controlla l’espressione genica circadiana. Per tentare di capire la relazione tra l’”orologio molecolare” e queste malattie, si è ricorsi a un modello di topo in cui si è causata un’alterazione circadiana cellula-specifica mediante delezione condizionale di Bmal1 per verificare i siti cellulari in cui la funzione dell’orologio molecolare è essenziale per la riproduzione femminile. Risultati: sono le cellule steroidogeniche ovariche che svolgo un ruolo cruciale per la riproduzione femminile, in particolare per l’impianto dell’embrione. Tale impianto nel modello murino con delezione condizionale Bmal1 può avvenire normalmente con il ricorso al progesterone o con il trapianto di un ovaio normale. Il trascrittoma ovarico rivela che la delezione di Bmal1 riduce l’espressione di trascritti associati al funzionamento dell’”orologio molecolare” e di geni critici per la regolazione della produzione del progesterone (Star)(steroidogenic acute regulatory factor).

Possibili strategie terapeutiche nel caso di alterazioni del ciclo circadiano che influenzano la fertilità.

DOK7 gene therapy benefits mouse models of diseases characterized by defects in the neuromuscular junction. Science 2014;345:1505. I movimenti volontari necessitano di una “conversazione” molecolare tra nervi motori e muscolo. Questo avviene a livello delle giunzioni neuro-muscolari (sinapsi, cioè connessione, periferica)(NMJ), che sono strutture di connessione fisica nervi-muscolo. Il neurotrasmettitore acetilcolina, rilasciato dal nervo, lega i suoi recettori densamente aggregati sulla membrana muscolare delle NMJ.

Se tale aggregazione recettoriale è inadeguata si producono alcune malattie neuromuscolari come alcune forme di miastenia e la Miastenia gravis. Il recettore chinasico muscolo specifico (MuSK) è necessario per la formazione e il mantenimento delle NMJ (il 50% dei pz con Miastenia gravis ha autoanticorpi anti MuSK) e la sua attivazione dipende dalla proteina citoplasmatica Dok-7 (downstream of tyrosine kinases 7). Topi che mancano di Dok-7 non sviluppano NMJ. Nell’uomo mutazioni recessive di questo gene sono causa della sindrome miastenica dei cingoli (Misatenia Ib, #254300) in cui le NMJ sono metà del normale. Nel lavoro usando un modello di topo con miastenia Dok7 l’introduzione del gene umano DOK7 tramite vettore virale (AAV) mostrano un allargamento delle NMJ e un considerevole aumento della forza muscolare e di vita. Lo stesso beneficio lo si è ottenuto con l’introduzione di DOK7 in un modello murino di un’altra malattia, la Distrofia muscolare Emery-Dreifuss 2 AD da mutazione del gene Lamina A/C (MIM #181350), in cui vi sono anomalie di formazione di NMJ.

Ci sono altre malattie, come la Sclerosi Laterale Amiotrofica da mutazione di SOD1 o le Atrofie Muscolari Spinali, che potrebbero beneficiare di questa terapia. In conclusione l’incremento di espressione di DOK7, aumentando la funzionalità di NMJ,  potrebbe essere una potenziale risorsa terapeutica per più di una malattia neuromuscolare.

CLEARance wars: PolyQ strikes back. Nature Neuroscience 2014;17:1140. Commento di un lavoro (Polyglutamine-expanded androgen receptor interferes with TFEB to elicit autophagy defects in SBMA. Pg. 1180) sulla patologia del sistema autofagico nella malattia Kennedy, che è un’atrofia spinale bulbare XL (MIM #313200)(SBMA) da espansione della tripletta trinucleotidica CAG (38 - 62 ripetizioni nei pz, 10 – 36 nei normali) nell’esone 1 del gene recettore degli adrogeni (diidrotestosterone)(AR) (mutazioni di questo gene causano la sindrome da insensibilità agli androgeni totale o parziale , ipospadia XL). In questa malattia neurodegenerativa, per la quale per ora non c’è cura, la battaglia tra accumulo di proteine malripiegate per la mutazione e i pathway cellulari che devono eliminarle è persa. Attualmente non è noto quando si verifica il blocco del pathway autofagico, né in quale tappa del processo avviene. Le risposte a queste domande, che almeno in parte sono date dai risultati del lavoro, può stimolare strategie terapeutiche (anche perché la m. Kennedy inizia nella 3^a-4^a decade di vita, ndr).

Utilizzando il modello murino di SBMA e linee cellulari e cellule staminali totipotenti (iPSC) di pz si osserva che il primo difetto molecolare dei tratti espansi poliglutamminici (poliQ) interessa la degradazione mediata dai lisosomi, in particolare un blocco della fusione degli autofagosomi con i lisosomi. Si dimostra che PoliQ interferisce con l’attivazione del fattore di trascrizione EB (TFEB) come avviene normalmente da parte di AR. In vitro nelle cellule di pz la patologia autofagica è normalizzata ricorrendo ad una sovraespressione di TFEB.

In conclusione il meccanismo patogenetico della m. Kennedy è quindi dovuto all’effetto di poliQ che riduce la funzione di TFEB alterando i processi autofagici.

Design of donecopride, a dual serotonin subtype 4 receptor agonist/acetylcholinesterase inhibitor with

potential interest for Alzheimer’s disease treatment. PNAS 2014; online 25 August: E3825. Della grande famiglia dei recettori serotoninici (5-HTR) di particolare interesse per l’Alzheimer è il sottotipo 4 (5-HT₄R), che è in grado di migliorare la memoria. E’ stato individuato un parziale agonista, chiamato donecopride, che svolge una funzione terapeutica di modulazione di 5- HT₄R e di inibizione acetilcolinoesterasi, con ottima attività in vitro che potrebbe normalizzare la neurotrasmissione colinergica che è alterata nell’Alzheimer. Inoltre promuove la secrezione della proteina neurotrofica che riduce la produzione del peptide neurotossico β-amiloide. In vivo, nel topo, questo prodotto ha significativi effetti procognitivi. Un nuovo e promettente approccio terapeutico nella m. Alzheimer.

Selective filtering defect at the axon initial segment in Alzheimer’s disease mouse models. PNAS 2014;111:1427. L’Alzheimer è considerata una malattia ad insorgenza in età avanzata. Nel topo transgenico con mutazione di PS1 (metà dei casi di Alzheimer familiare ad insorgenza precoce hanno mutazioni di questo gene, ndr) vi sono anomalie neuronali che si verificano precocemente durante lo sviluppo, anomalie del traffico proteico, della traslocazione proteica e della formazione del segmento iniziale assonico. Questo va d’accordo con i diversi profili di espressione proteica dei portatori presintomatici di mutazioni di PS1 (presenilina 1) rispetto ai non portatori. Sempre in questi portatori asintomatici sono presenti all’analisi PET immagini di aumentata captazione corticale del radiofarmaco rispetto ai non portatori ben 20 anni prima dell’inizio del deficit cognitivo. Tutto fa pensare ad un possibile interessamento dello sviluppo neuronale nella patogenesi dell’Alzheimer.

Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9–mediated editing of germline DNA. Science 2014;345:1184. Genome editing (clustered regularly interspaced short palindromic repeat/Cas9)(CRISPR/Cas9) per correggere una mutazione germinale del gene della distrofina (Dmd) nel topo mdx (mutazione nonsenso nell’esone 23), che è un modello animale della Distrofia M. Duchenne e vederne gli effetti istopatologici muscolari e clinici. L’editing genomico eseguito negli zigoti di topo per correggere la mutazione possibilmente in tutte le cellule dell’organismo, tra cui i progenitori miogeni, ha prodotto animali con mosaicismo genetico con correzione del gene dal 2% al 100%. La correzione del fenotipo muscolare (arti, diaframma, cuore) prescinde in parte dall’efficienza della correzione genica, infatti la correzione di solo il 17% degli alleli mutanti è stata sufficiente per avere la distrofina espressa nella maggioranza delle miofibre con ridotti aspetti istopatologici tipici del topo mdx. Questo vantaggio funzionale migliora con l’età. La CPK decresce proporzionalmente con la percentuale di cellule corrette. E la forza muscolare è nettamente migliorata.

Venendo all’uomo, il genome editing germinale non è per ora proponibile, ma con il superamento di alcune attuali difficoltà tecniche, potrebbe essere applicato nelle cellule postnatali in vivo, indirizzando ad esempio il sistema CRISPR/Cas9 alle cellule muscolari distrofiche ricorrendo a virus adeno-associati.

MALATTIE COMPLESSE/STUDI ASSOCIAZIONE

Genome-wide association analyses identify variants in developmental genes associated with hypospadias. Nature Genetics 2014;46:957. L’ipospadia è una malformazione congenita in cui il meato uretrale non è posizionato centralmente e distalmente sul glande ma nella parte ventrale del pene o addirittura alla sua base o a livello perineale. La sua frequenza è di 4.5 casi/1.000 nati. La correzione è chirurgica ed è associata in età adulta a problemi di erezione e di eiaculazione. Le cause possono essere ambientali (gravidiche, teratologiche come l’esposizione in gravidanza a dietilstilbestrolo) o genetiche sindromiche. Sono descritti casi familiari di ipospadia isolata con rischio relativo di ricorrenza per gemelli di 50.8, per parenti di primo grado di 11.6 e parenti di secondo grado di 3.27 (Am J Epidemiol 2008;157:251). L’unica associazione genetica nota riguarda una variante comune di DGKK (diacil glicerolo chinasi K).

L’analisi di associazione genome wide (GWAS) di quasi 3.000 persone con ipospadia isolata ha consentito di individuare 18 regioni genomiche associate, che spiegano il 9.4% della suscettibilità a sviluppare tale condizione. Parecchie regioni identificate contengono geni che hanno un ruolo chiave nello sviluppo embrionale (tra cui HOXA4, IRX5, IRX6 and EYA1) e alcuni pathway dello sviluppo che potrebbero essere importanti per altre condizioni.

Large-scale meta-analysis of genome-wide association data identifies six new risk loci for Parkinson’s disease. Nature Genetics 2014;46:1829. Meta-analisi di uno studio di GWAS che ha coinvolto oltre 13.000 pz con Parkinson a cui si sono aggiunti successivamente per conferma altri (oltre 5.300) casi. Sono stati individuati 6 nuovi loci associati oltre a confermarne altri 24 con 28 varianti di rischio in quanto 4 loci (GBA, GAK-DGKQ, SNCA e la regione HLA) contengono una seconda variante a rischio indipendente.

Sebbene l’effetto di ogni singolo locus sia modesto, il rischio cumulativo è considerevole.