martedì 7 marzo 2017

Articoli Genetica Clinica/Umana Settembre 2016. R Tenconi



Scelta di articoli di Genetica Clinica/Umana pubblicati in Settembre 2016 nelle seguenti riviste: British Medical Journal, Lancet, Lancet Neurology, Nature, Nature Biotechnology, Nature Genetics, Nature Medicine, Nature Neuroscience, Nature Reviews Genetics, Nature Reviews Neuroscience, Nature Reviews Neurology (new entry), NEJM, PNAS, Science & Cell.

ARTICOLI DI INTERESSE
A curated gene list for reporting results of newborn genomic sequencing. Genetics in Medicine 12 January 2017. doi:10.1038/gim.2016.193. Si parla da qualche anno dell’opportunità di applicare il NGS per la diagnosi rapida (<5 giorni) ed un’eventuale terapia precoce più efficace nei neonati con una patologia grave da causa non nota (Fast sequencing saves newborns. Nature 2014;514:13)(selezione articoli Settembre 2014), Genetics in Medicine 25 Sept 2014 e statement di EJHG 28 January 2015). BabySeq Project è uno studio randomizzato e controllato che vuole verificare gli esiti clinici e genetici, economici e sociali dell’applicazione di NGS nei neonati. Ci si è ormai resi conto che in clinica è tempo di accelerare il processo diagnostico in questi nati (per terapia, prevenzione, evitare l’odissea diagnostica e management inappropriati). In questo progetto per favorire l’interpretazione di NGS ed accelerare il processo diagnostico si è voluto preparare un elenco di 1.514 geni malattia, di cui 954 che secondo la metodologia adottata è opportuno che vengano riportati in consulenza e in modo appropriato. Una prima applicazione di questo elenco in 15 nati ha consentito di evitare il controllo manuale del 41% delle varianti rare.

Meta-analysis of 2,104 trios provides support for 10 new genes for intellectual disability. Nature Neuroscience 2016;19:1194. Analisi mutazionale mediante WES di un insieme di pz con disabilità intellettiva (ID) con una coorte di nuovi 820 pz e loro genitori e dati di famiglie già pubblicate, per un totale di 2.104 trio pz-genitori in cui sono state individuate 2.637 mutazioni de novo di 1.990 geni. Dopo l’esclusione dei casi con geni della ID il campione rimasto è di 1.471 soggetti con 1.400 mutazioni de novo di 1.235 geni. Tramite meta-analisi dei dati combinati è stato possibile individuare 10 nuovi geni candidati della disabilità intellettiva: DLG4 (target dei FMRP e gene della plasticità sinaptica), PPM1D e RAC1 (geni espressi nell’embrione), TLK2 e TRIP12 (modificatori della cromatina), SMAD6 (co-repressore trascrizionale), SON (processamento co-trascrizionale RNA), SOX5 (fattore di trascrizione che regola lo sviluppo embrionale con un ruolo nello sviluppo dei progenitori neurali) , SYNCRIP (stabilizzazione RNA , TCF20 (attivatore trascrizionale). L’analisi fenotipica comparativa di 18 pz del gruppo iniziale con mutazione de novo di questi 10 geni mostra che vi è una forte sovrapposizione clinica per mutazione di alcuni di questi geni, con presenza anche di dismorfismi, deficit di crescita ed altro (Supplementary Table 7). I pathway molecolari in cui sono inseriti questi geni riguardano quelli tipici delle patologie del neurosviluppo come l’autismo, la schizofrenia l’encefalopatia epilettica e la disabilità intellettiva. Molto interessante: elencati in Supplementary Table 4 l’elenco aggiornato dei 1.538 geni noti con mutazione mono-biallelica o in emizigosi causa di ID.

MALATTIE NEUROLOGICHE/NEUROMUSCOLARI/NEURODEGENERATIVE/ PSICHIATRICHE
Alzheimer’s disease risk: amyloid versus neurodegeneration. Lancet Neurology 2016;15:1000. Ancora sui meccanismi patogenetici (ma l’argomento è rilevane per i risvolti terapeutici, ndr). Commento di un articolo sullo stesso fascicolo (Clinical and cognitive trajectories in cognitively healthy elderly individuals with suspected non-Alzheimer’s disease pathophysiology (SNAP) or Alzheimer’s disease pathology: a longitudinal study. Pg. 1044). The National Institute on Ageing–Alzheimer’s Association‘s (NIA-AA) ha proposto di considerare i depositi di β-amiloide (Aβ) cerebrali e la neurodegenerazione come biomarcatori utili per individuare persone a rischio di tale patologia. I depositi cerebrali di Aβ (PET) e la neurodegenerazione (MRI, volume dell’ippocampo) sono presenti nel 50-60% delle persone >60 anni e in questo lavoro si è voluto studiarne l’evoluzione clinica e cognitiva in 573 australiani (58% donne) sani di età di 73.1 anni (DS 6.2). L’amiloidosi cerebrale è un fattore di rischio di declino cognitivo e di progressione verso lo stadio sintomatico e la neurodegenerazione ne è un cofattore. Ma la neurodegenerazione da sola non è un fattore di rischio di declino cognitivo.

Amyloid-β transmission or unexamined bias? Nature 2016;537:E7. Sono state riportate persone con bassa statura trattate con GH di origine umana (estratto da cadaveri) che hanno poi sviluppato la m. iatrogena Creutzfeldt–Jakob. All’autopsia rilevati depositi di parenchimali e vascolari di β amiloide nonostante la loro giovane età (36-51 anni)(vedi selezione articoli Settembre 2015: Alzheimer’s fear in hormone patients. Nature 2015;525:165 news su Evidence for human transmission of amyloid-β pathology and cerebral amyloid angiopathy. Pg. 247 e Amyloid-β pathology induced in humans. Pg 193). Da qui l’ipotesi di una contaminazione ipofisaria da prioni e della trasmissibilità degli aggregati di Aβ. In questa breve comunicazione, piuttosto critica delle conclusioni a cui sono arrivati gli AA, si sostiene che la sequenza degli eventi non è provata e che ci sono ipotesi alternative che spiegano la comparsa della malattia da prioni e l’accumulo amiloideo.

Phase III trial of anti-tau drug generates mixed messages. Nature Rewies Neurology. Online 12 August 2016. Un aggiornamento sui risultati di una sperimentazione clinica con un inibitore dell’aggregazione tau (LMTM), meccanismo patogenetico in alcune malattie neurodegenerative, in casi con Alzheimer lieve: non si è raggiunto l’obiettivo primario cioè un effetto sul declino cognitivo. Si stanno ancora studiando comunque gli effetti in una sottopopolazione di pz trattati.

Alzheimer risk variants affect children’s brains. Nature Reviews Neurology. September 2016. Commento dell’articolo Gray matter maturation and cognition in children with different APOE ε genotypes. Neurology 2016;87:585 il cui obiettivo era di verificare se bambini con 6 differenti genotipi Apolipoproteina E (APOE) ε abbiano differenze di maturazione di sostanza grigia, in particolar modo coloro con alleli ε4 e ε2 che sappiamo associati ad esito peggiore in molte malattie neurologiche.
In questo studio di più di 1.000 soggetti sani di 3-20 anni sono stati valutati per gli effetti dei 6 genotipi sulla maturazione cerebrale (macroscopica e microscopica corticale e strutture sottocorticali della materia grigia mediante MRI 3-tesla e morfometria automatica con il software FreeSufer) e sulle relative capacità cognitive. Si osserva un alterato sviluppo cerebrale nei portatori di APOE ε4 e si conclude che i genotipi ε4ε4 e ε2ε4 sembrano influenzare lo sviluppo cerebrale e l’invecchiamento cerebrale nelle età più avanzate. Da qui il suggerimento di determinare nei bambini il polimorfismo APOE per intervenire con interventi o misure preventive precoci per la prevenzione della demenza (giusto suggerimento, che va discusso dal punto di vista etico ed organizzativo, ndr).

Lithium promotes accumulation of brain iron via tau suppression. Nature Reviews Neurology September 2016. Commento di un articolo (Lithium suppression of tau induces brain iron accumulation and neurodegeneration. Mol Psychiatry 2016; Jul 12. doi: 10.1038/mp.2016.96) sulle cause di un effetto collaterale della terapia con litio, il farmaco di prima scelta per il disturbo bipolare, costituito dalla comparsa di tremori delle mani simili a quelli del Parkinson e che portano alla sospensione della terapia. Il farmaco, proposto anche per altre taupatie come l’Alzheimer e la Sclerosi Laterale Amiotrofica, sembra ridurre l’espressione di tau a livello cerebrale. In questo lavoro si vogliono chiarire le basi neurobiologiche di tali effetti. Nella degenerazione parkinsoniana alcuni studi preliminari portano a ritenere che la riduzione di espressione di tau solubile comporti un accumulo di ferro nella sostanza nigra. In questo lavoro si dimostra che nel topo normale il litio a basse dosi riduce nel tessuto cerebrale i livelli di tau solubile e che vi è accumulo di ferro nella corteccia e nella sostanza nigra con fenotipo di degenerazione dei neuroni dopaminergici e deficit motori simile a quelli riscontrati nel topo KO tau. In colture di cellule neuronali si dimostra che vi è accumulo di ferro modulando l’espressione della proteina tau. A riprova di quanto osservato l’analisi delle immagini alla RM cerebrale di partecipanti a precedenti sperimentazioni con litio si è osservato un tempo di rilassamento T2 ridotto nella sostanza nigra, verosimilmente un segno dell’accumulo di ferro. Tale accumulo ha indubbiamente un effetto neurotossico che spiega la sintomatologia talora presente nei pz trattati con litio. D’altra parte, conclude il commento, il ferro è essenziale per il neurometabolismo ed è necessario per la produzione dell’eme, la funzione mitocondriale e la sintesi dei neurotrasmettitori e forse proprio per questo l’aumento del contenuto di ferro svolge l’azione benefica della terapia con litio.

An immune protein facilitates neuronal uptake of a Parkinson’s disease–associated protein
NEK1 variants confer susceptibility to amyotrophic lateral sclerosis. Nature Genetics 2016;48:1037. Applicato WES in 1.022 casi di ALS familiare (FALS) e 7.315 controlli per identificare nuovi fattori di rischio. Trovata un’associazione tra varianti con perdita di funzione del gene (NEK1) e rischio di FALS. In un’altra analisi WGS in 4 pz di una comunità isolata olandese (di <25.000 persone) identificati 4 pz sporadici (SALS) con fenotipo simile con alto indice di consanguineità; la mappatura di autozigosità ha consentito di individuare 4 varianti candidate, che includono una variante di NEK1 (p.Arg261His), due dei 4 pz erano omozigoti per questa variante mentre due erano eterozigoti, facendo ritenere tale variante come un fattore di rischio di ALS. In una successiva analisi di un ampio campione di pz con SALS e controlli si è confermata una significativa associazione tra la variante su specificata o varianti con Lof di NEK1. In totale si stima che il 3% dei pz ALS siano portatori di varianti a rischio di questo gene, che è coinvolto in varie funzioni cellulari come la formazione delle cilia, la risposta a danni del DNA, la stabilità dei microtubuli, la morfologia neuronale e la polarità degli assoni.

ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks. Nature Neuroscience 2016;19:1256. Il ricorso a modelli in vitro ottenuti da cellule staminali totipotenti indotte da cellule neuronali spinali embrionali fetali ed adulte umane unitamente al trascrittoma ha consentito in questo lavoro di migliorare le tecniche che consentono di ottenere modelli di iPSC più idonei per lo studio della patogenesi della ALS.

GENETICA UMANA/CLINICA
High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature 2016;537:508. Nei mammiferi un terzo dei geni sono considerati essenziali per la vita. Il KO di questi geni nel topo ha consentito di conoscerne meglio la funzione ed il loro ruolo nelle malattie congenite dell’uomo. Nell’ambito di uno studio del International Mouse Phenotyping Consortium, che vuole generare e caratterizzare fenotipicamente 5.000 linee KO di topo, producendo i primi 1.751 KO sono stati individuati e caratterizzati i fenotipi di 410 geni letali in epoca embrionale, fenotipi analizzati con diverse metodiche, come la tomografia a proiezioni ottiche (OPT), tomografia microcomputerizzata (micro-CT) e la microscopia episcopica ad alta risoluzione (HREM). Questi risultati contribuiscono a conoscerne la funzione ed il ruolo non solo nelle malattie monogeniche ma anche in quelle complesse. Il catalogo delle linee KO con i relativi fenotipi è consultabile tramite il portale IMPC (http://www.mousephenotype.org). Da sottolineare che è comune la presenza di variabilità sia dell’espressività che della penetranza anche con lo stesso background genetico. Da questi risultati risulta anche che, come atteso, i geni malattia dell’uomo sono in genere geni essenziali, che costituiscono quindi una fonte di informazioni utile per la prioritizzazione e la validazione delle varianti trovate nello screening mutazionale applicato in diagnostica clinica.

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Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing. Nature Genetics 2016;48:1060. Le malformazioni cardiache congenite (CHD) sono i difetti congeniti più frequenti (incidenza neonatale 0.8-1%). Nonostante la loro frequenza e le numerose forme monogeniche sia nell’uomo che nel topo il rischio di ricorrenza nei consanguinei di primo grado è basso (2.7%), indicando così un’alta proporzione di mutazioni causative de novo (DNM) e/o una loro penetranza incompleta o un effetto poligenico/mutlifattoriale. Tra le mutazioni de novo una rilevante particolare frequenza è stata attribuita a quelle troncanti (PTV), soprattutto presenti nei bambini sindromici con manifestazioni cliniche extra cardiache (10%), come peraltro presenti nei bambini con deficit cognitivo grave senza CHD e significativamente più frequenti rispetto ai pz con autismo. Questa considerevole differenza di DNM tra casi sindromici o non sindromici mima quanto osservato nell’autismo tra casi con o senza deficit intellettivo.
In questo studio è stato applicato WES in 1.891 probandi, sia sindromici (S-CHD, n° 610) che non sindromici (NS-CHD, n° 1.281) trovando, come già noto da altri studi, solo nei sindromici un arricchimento di troncanti nei geni noti delle CHD de novo ma non ereditate, mentre nei non sindromici vi è un significativo arricchimento di troncanti di un gene CHD ereditate da un genitore non affetto. Sono state trovate 3 patologie significative interessanti il gene CDK13, CHD4 e PRKD1. In 7 con S-CHM identificate 6 de novo (di una non è noto) missenso in un dominio altamente conservato di CDK13, in 4 la stessa; il quadro clinico è di difetti settali con gestalt facciale caratteristica, deficit cognitivo, lieve microcefalia e, in 2, agenesia del corpo calloso; il topo KO per il paralogo ha una letalità embrionale. In 5 con S-CHD trovate 4 missenso ed una delezione in frame, tutte de novo di CHD4, tre con Tetralogia Fallot, una coartazione aortica e uno con difetto settale associate a deficit cognitivo, in 2 malformazione Chiari e in ¾ maschi con anomalie genitali; quadro clinico che richiama la s. CHARGE da mutazione del gene paralogo CHD7. E infine in 3 con S-CHD trovata una mutazione missenso de novo di PRKD1, in due la stessa mutazione, con un probabile effetto di acquisizione di funzione; due pz avevano difetto settale AV, il terzo stenosi polmonare, sempre associati a grave deficit cognitivo e difetti ectodermici (cute asciutta e anomalie delle unghie). Da notare che è stato recentemente segnalata in un pz con tronco arterioso autozigosità di una mutazione troncante di PRKD1. Nei NS-CHD messo in evidenza un significativo arricchimento di mutazioni troncanti ereditate da un genitore.
Quindi in conclusione dimostrato il contributo delle mutazioni de novo e l’incompleta penetranza sono diversi nei due gruppi di pz (S-CHD vs NS-CHD) con un ruolo maggiore delle de novo nelle prime e la trasmissione di varianti ad alto rischio nelle seconde. Individuati 3 nuovi geni delle CHD sindromiche (PRKD1, CHD4 e CDK13), il cui sequenziamento consente di far crescere dal 23 al 26% la probabilità di identificare una mutazione de novo da considerarsi probabilmente diagnostica nei casi con S-CHD.

Germline NLRP1 Mutations Cause Skin Inflammatory and Cancer Susceptibility Syndromes via Inflammasome Activation. Cell 2016;167:187. Il complesso proteico dell’inflammasoma, importante componente dell’immunità innata con funzione di eliminare i patogeni, è costituito dalle proteine NLR (nucleotide-binding domain, leucine-rich repeat), dalla proteine adattatrice ASC e dalla Caspasi-1. Se il complesso inflammasomico viene attivato in modo anomalo è causa di malattia, in particolare di un gruppo di malattie autoinfiammatorie da mutazione germinali attivanti delle proteine sensore dell’inflammasoma come CAPS (cryopyrin-associated periodic syndromes), FMF delle sindromi della Febbre mediterranea (FMF) e certe forme di sindrome da attivazione macrofagica. In questo lavoro in 4 famiglie con più affetti con febbre periodica, segni infiammatori senza infezione da attivazione spontanea dei macrofagi e rilascio delle citochine pirogeniche si dimostra che due malattie cutanee mendeliane con sovrapposizione di segni clinici, MSPC con cheratocantomi palmo-plantari cutanei congiuntivali e corneali con alto rischio di trasformazione in carcinoma a cellule squamose e FKLC, chiamata cheratosi lichenoide cronica familiare, sono forme alleliche (MIM #615225), dovute a differenti mutazioni germinali con acquisizione di funzione del sensore inflammasomico NLRP1 (NLR family, pyrin domain containing protein 1). Ne vengono suggeriti i meccanismi patogenetici, incluse le cause della caratteristica ricorrenza delle lesioni focali, documentando quindi la presenza di un gruppo di malattie inflammasomiche senza febbre ed indicando il ruolo sinora non conosciuto di NLRP1 nelle malattie infiammatorie cutanee e nella predisposizione al cancro.

Dysregulated exocytosis of angiopoietin-2 drives cerebral cavernous malformation. Nature Medicine 2016;22:971. News  & Views di uno studio per chiarire il meccanismo patogenetico della malformazione cavernosa cerebrale (CCM)(Endothelial exocytosis of angiopoietin-2 resulting from CCM3 deficiency contributes to cerebral cavernous malformation. Pg. 1033), anomalie venose causa di emorragie cerebrali, convulsioni e paralisi non identificabili con l’arteriografia cerebrale (vedi selezione articoli Luglio 2015 Sulindac metabolites decrease cerebrovascular malformations in CCM3-knockout mice. PNAS 2015;112:8421), patologia che può essere sporadica o familiare. Quando familiare nel 90% dei casi è da mutazione dominante con perdita di funzione di KRIT1 (CCM1), CCM2, o PDCD10 (CCM3) con un meccanismo two-hit (una mutazione germinale ed una somatica). I prodotti dei tre geni formano un complesso proteico adattatore coinvolto nel controllo della stabilità endoteliale e mutazioni di un gene del complesso sono causa di destabilizzazione dell’endotelio. In questo lavoro nel modello murino e in vitro in tessuto cerebrale di pz con la delezione di CCM3 si osserva aumento di esocitosi e di secrezione di ANGPT2 (angiopoietina 2, antagonista di angiopoietina 1) mediata da UNC13B (proteina presinaptica che promuove la fusione delle vescicole sinaptiche) intorno ai microvasi sanguigni cerebrali dilatati, secrezione osservata solo a livello cerebrale e retinico, non in altri organi (in accordo quindi con la localizzazione delle lesioni nell’uomo). La delezione di UNC13B che blocca la secrezione di ANGPT2 dalle cellule endoteliali o il trattamento con anticorpo neutralizzante ANGPT2 normalizza le lesioni cerebrali e retiniche da difetto di CCM3 limitato alle cellule endoteliali, in particolare normalizza l’alterazione delle giunzioni delle cellule endoteliali, la dilatazione dei vasi e la dissociazione pericitica dai vasi. In conclusione l’aumento di secrezione di ANGPT2 è il meccanismo patogenetico per il solo difetto di CCM3 (non per gli altri due), che contribuisce alla progressione della CCM e che potrebbe essere correggibile farmacologicamente. Questo potrebbe spiegare il fatto che le mutazioni di CCM3 comportano un fenotipo più grave rispetto a quello da mutazione di CCM1 o CCM2.

Type 2 diabetes: genetic data sharing to advance complex disease research. Nature Rewiews Genetics 2016;17:535. Interessante storia di quanto sappiamo dei geni predisponenti dagli studi GWAS (Fig. 1). Ma è necessario “an integrated T2D knowledgebase, designed for a worldwide community to access aggregated large-scale genetic data sets, as one paradigm to catalyse convergence of these efforts”.

Towards precision medicine. Nature Reviews Genetics 2016;17:507. Discorso generale sulla medicina di precisione: l’applicazione del sequenziamento genomico e l’ottimizzazione delle analisi dei risultati ottenuti con l’uso di appropriati algoritmi di allineamento, con una copertura di qualità, con soluzioni per i problemi posti dei geni paraloghi e con l’adozione di standard per la chiamata e l’interpretazione delle varianti consentendo, se vi sarà una condivisione mondiale ed accurata dei dati genotipici e fenotipici, di accelerare l’identificazione di nuovi geni causativi e una miglior comprensione dei meccanismi patogenetici delle malattie per poter così applicare una terapia di precisione. In Tab. 1 esempi di patologie mendeliane suscettibili di provvedimenti terapeutici o preventivi, di oncologia di precisione e di farmacogenomica.

Nature Outlook
Precision Medicine. Nature 2016;537:S49. Outlook sponsorizzato da Illumina. Presentazione dei vari articoli su un argomento di cui si parla da tempo.
Medical histories. S52. Individualized treatments are not new. Infatti la donazione di sangue da più di un secolo (1907) viene fatta tenendo presente la compatibilità. Ma ora siamo un po’ più precisi. Storia della medicina partendo dal 4.000 aC con la medicina indiana ayurvedica e trattamenti personalizzati alla costituzione individuale (prakriti). Arrivando alla decisione di D. Cameron del 2012 del 100,000 Genomes Project per persone con cancro o malattie rare in famiglia e di Barak Obama nel 2015 con la Precision Medicine Initiative da applicare nella clinica con un finanziamento di 215 milioni $.
Technology. Read the instructions. S54. The rise of fast, cheap DNA sequencing. Sequenziamento di tutti i geni in 1 giorno al costo di soli di 1.000 $ e l’introduzione nella pratica clinica soprattutto per la diagnosi di malattie rare quando le tecniche convenzionali non hanno funzionato.
Diagnosis. A clear answer. S64. Bella la sintesi del nostro lavoro: Baffling (± incomprensibili) symptoms can be resolved. Perché è difficile vivere con una malattia rara senza diagnosi e il NGS può favorirla. Donna di 36 anni che dai 6 anni ha incominciato a camminare sulla punta delle dita e poi ad avere dolori, debolezza periodica degli arti, che si sono deformati, difficoltà a camminare ed avere una voce strozzata. Ha avuto la fortuna di entrare in un progetto di ricerca nel 2012 che ha consentito la diagnosi di Distonia dopa sensibile e quindi suscettibile di una cura risultata efficace. Questo rappresenta un’eccezione ma in ogni modo ci si può accontentare della diagnosi, per interrompere un’odissea diagnostica (viene fatto l’esempio di una b. con mutazione di con microcefalia e deficit cognitivo e dopo anni e vari test trovata con WES mutazione di DYRK1A). Il successo diagnostico del NGS, più alto ricorrendo al trio, è del 40-75% per i deficit visivi, ritardo di sviluppo, malattie acute infantili. La diagnosi consente di prevedere l’evoluzione della malattia e adottare un adeguato management medico sia terapeutico specifico che preventivo e la valutazione della ricorrenza nella famiglia. Ma perché tanti casi negativi per malattie che sospettiamo genetiche? Per difficoltà interpretative del gran numero di varianti che risultano dall’esame che possono essere almeno in parte superate con il confronto dei risultati con altri laboratori o ricorrendo a database (http://www.matchmakerexchange.org/). Anche quando una mutazione spiega la malattia è necessaria un’ampia analisi statistica e accertamenti clinici che la confermano. E sono stati implementati sistemi per introdurre addirittura WGS entra nella pratica clinica senza l’assistenza del medico genetista (https://cser-consortium.org/projects/28)(la voce dello sponsor, ndr).
Gene Therapy. Industrial strength. Nature 2016;537:S57. Biotech companies seek approval. Dopo molte battute di arresto finalmente la terapia genica sta passando dalla fase di limitate sperimentazioni accademiche all’approvazione. Interessante la figura con il numero di pubblicazioni sull’argomento dalla fine degli anni ’80 ad oggi con >3.000/anno nel 2015, anche se sono poche per ora quelle approvate: Gendicine in Cina (adenovirus ricombinante p53, trattamento per cancro del collo-cranio), Glybera (approvata EMA per liperchilomicronemia familiare, farmaco costosissimo, insuccesso economico), Strimvelis (approvazione EMA per ADA-SCID) e altri prodotti in corso di approvazione FDA per patologie oculari (retiniche) ed ematologiche (emofilia) anche maligne. Il principale problema della terapia genica è costituito dal fornire sufficiente quantità di prodotto del gene difettoso nella cellula bersaglio e quindi il suo compito sinteticamente è “delivery, delivery and delivery” mediante l’uso di vettori virale e ora con il ricorso a tecnologie di ingegneria genetica (CRISPR–Cas9). Per alcuni tipi di cancro sono in fase avanzata di realizzazione terapie che usano cellule T trasformate reintrodotte nel pz. E poi le terapie, anche queste in fase avanzata, con anticorpi monoclonali. Il problema molto dibattuto è quello dei costi, ma per alcune patologie come l’emofilia la terapia consiste in una sola somministrazione i cui costi vanno bilanciati con i costi sociali e soprattutto medici della terapia sostitutiva attuale. La terapia genica avrà sicuramente un impatto sulla pratica medica, con successi ed insuccessi. “It’s still science, we’re still learning, this is not routine. We’re at the very beginning”.
Pharmacogenetics. The right drug for you. S60. Can our genetics improve prescribing? Sappiamo abbastanza per introdurre nella pratica clinica una prescrizione personalizzata? Sono pochi i centri di farmacogenomica che stanno promuovendo la sua applicazione clinica per prescrivere il farmaco più efficace e con minori effetti avversi.
Perspective. The precision-oncology illusion S63. But some researchers argue that more evidence of benefit is required first.
Participation. Power to the patients. S66. Per la Medicina di precisione è fondamentale avere i dati clinici e genetici dei pz e della popolazione sana. Le ricerche condotte centrate sul paziente hanno infatti dimostrato che sono produttive per i ricercatori, le compagnie farmaceutiche e soprattutto per i pz stessi, che sono stimolati a collaborare attivamente anche con fondazioni laiche che aiutano nel reclutamento, forniscono dati, suggerimenti procedurali e fondi. Con interviste e storie vissute.
Ma c’è la questione della privacy e della importanza di ottenere la fiducia di chi offre i propri dati.
Privacy. The myth of anonymity. S70. I tuoi dati genomici possono non essere protetti in quanto anche la loro anonimizzazione può essere inefficace perché “with some knowledge and some dedicated effort, you can identify people from genomic data” e la partecipazione ad alcuni progetti addirittura è impossibile per gli scopi che si propongono (Personal Genome Project). Ma talora anche chi è d’accordo nel rendere noti i propri dati poi potrebbe ripensarci: curiosa la nota storia di James Watson, quello della doppia elica, che avendo partecipato al progetto genoma e visto tra le varianti trovata in lui varianti a rischio di Alzheimer aveva chiesto di eliminare almeno quella dell’Apolipoproteina E, ma questo non avrebbe modificato il rischio ed eliminarle tutte avrebbe reso il suo sequenziamento inutile (“more they protect privacy, the less useful they make the data”). Ma cosa comporta la possibilità di riconoscere l’identità di una persona? Fare conoscere ad altri la partecipazione ad un dato progetto, legame genetico o meno, malattie o dipendenze se i dati genetici sono legati alla storia medica, rischio assicurativo. Ma sappiamo che oggi con i vari sistemi di comunicazione la privacy sta diventando una parola astratta, basta vedere i “likes” su Facebook e si ha con buona precisione l’orientamento sessuale, l’affiliazione politica e l’etnia.
Allora a chi dona il proprio DNA è necessario offrire chiarezza ed onestà nel proporre una ricerca genomica con un consenso informato adeguato che precisi anche che i dati genetici potranno in futuro essere riusati per altri scopi scientifici. Due commenti molto condivisibili come medico (ndr): “We can’t do research on human beings and look people in the eye and promise them that nothing bad will ever happen” e “If you talk to people who have children with undiagnosed diseases, they would tell you: ‘We would gladly forgo privacy in the interest of accelerated research”.
Q&A. Precision medicine goes megascale. S69. How the US Precision Medicine Initiative (PMI)(NIH) works, vedi Planning for US Precision Medicine Initiative underway. Lancet 2015;385:2448)(articoli Giugno 2016)(grazie Presidente Obama, ndr). Intervista a chi ha ideato il progetto NIH. 1. What does the Precision Medicine Initiative need with one million volunteers? Lo scopo della PMI è di raccogliere la maggior quantità di dati possibili per sapere e capire quali infrastrutture e quale cultura sono necessarie per le terapie mirate e per la prevenzione in modo da preservare la salute delle persone.
2. What have you learned from the huge cohort programmes in recent years, such as the Million Veteran Program and the UK Biobank? Il progetto raccogliere dati secondo criteri prestabiliti, mirati, non ogni informazione disponibile come negli studi precedenti. E con dati rapidamente disponibili a tutti i partecipanti al progetto, non solo ai ricercatori.
Will participants play an active part in the PMI? Sì, in questo progetto i partecipanti sono stati coinvolti non solo nella stesura e nella gestione del programma ma anche decidono quali loro dati ed a chi renderli disponibili.
Recruiting volunteers for clinical studies is difficult. How do you plan to do it? Reclutamento tramite i medici di famiglia e la loro collaborazione per la raccolta dati e poi per chi “alza la mano“, senza selezione e non solo i “tech-savvy, fitness-conscious middle-aged or young folk”.
What new issues does that raise for trials? Molte domande tra cui come si fa il reclutamento, come raggiungere chi è in difficoltà economica o sta poco bene, come si mantengono i contatti anche con chi non usa internet.
Are you also grappling with questions raised by incorporating data gathered by patients? Certo, l’integrazione dei vari dati raccolti con diversi sistemi (es. dispositivi mobili) consente di raccogliere dati diversi.
How will you maintain trust between all players, especially the volunteers? L’imperativo è essere super-trasparenti in modo che ogni partecipante in qualsiasi momento possa sapere cosa stiamo facendo, essere collaborativi e proteggendone la privacy e la sicurezza.
What do you worry about late at night? La privacy e la sicurezza ponendo attenzione di essere rapidi ma nello stesso tempo fare le cose giuste.

Nature Outlook
Lysosomal Storage disorders. Nature 2016;537:S145. Outlook sponsorizzata da alcune case farmaceutiche (Alexion, Ultragenyx, Shire plc e Biomarin). Una cinquantina di malattie rare o rarissime (la più frequente 1:50.000 nati vivi) a comparsa pediatrica o in età adulta con vari segni clinici tra cui convulsioni, demenza, epato e splenomegalia e anomalie scheletriche, accomunate da un unico meccanismo patogenetico costituito dal coinvolgimento dei lisosomi.
Cell Biology: Myriad (= miriadi, non c’entra la compagnia Myriad Genetics, ndr) maladies. Pg. S146. What goes wrong to cause an LSD? Bellissima sintesi della biologia, epidemiologia (in totale frequenza di 180:1 milione di nati vivi), storia della loro individuazione e delle terapie praticate o in sperimentazione.
Biomedicine: A rare opportunity. Pg. S148. The lysosome has a role in many diseases. Infatti patologie di questi organelli non causano solo una loro disfunzione da accumulo di materiale (LSD) ma anche disfunzioni di varie funzioni cellulari che determinano malattie comuni e complesse. Nella m. Niemann-Pick C, nel 95% dei casi è da mutazione di NPC1, l’accumulo è costituito da colesterolo con gravi conseguenze prevalentemente neurologiche progressive e si è ora scoperto che le cellule di pz con tale malattia sono insensibili al virus Ebola perché il suo recettore non è sulla superficie della cellula ma all’interno del lisosoma. E questo potrà aiutare i ricercatori a trovare una terapia per questa letale infezione. I lisosomi quindi non sono semplici contenitori di rifiuti della cellula (ricercatori italiani hanno condotto studi fondamentali per chiarire la funzione lisosomiale e il ruolo d mTORC1 e il fattore di trascrizione TFEB che stanno portando ad ipotizzare terapie mirate non solo per le LSD ma anche per altre più comuni. Mutazioni di Glucocerebrosidasi β se bialleliche sono causa di m. Gaucher e in eterozigosi sono un fattore di rischio di Parkinson con corpi Lewy (MIM  #127750). Mutazioni in eterozigosi di Progranulina, regolata da TFEB, sono causa di una Demenza Fronto-Temporale lobare ad origine tardiva (MIM #607485) e in omozigosi ad una forma di Lipofuscinosi ceroide (MIM #614706). Mutazioni di presinilina, che agisce in un complesso molecolare (vATPase) essenziale per la funzione di degradazione e digestione del contenuto lisosomiale e che forma la componente catalitica della gamma-secretasi responsabile del clivaggio proteolitico della proteina precursore amiloide β, causano in eterozigosi una forma di Alzheimer precoce e di altre malattie neurologiche. Questo fa pensare che LSD sia il meccanismo patogenetico di alcune malattie neurodegenerative. Qualche utilizzo immediato? Un suggerimento di ricercatori americani (che mi sembra un po' azzardato, ndr): inibire con farmaci temporaneamente NPC1 per evitare l’infezione da Ebola.
Perspective. The rare must become common. Pg. S151. More screening to aid diagnosis. Cosa comporta il ritardo diagnostico (in media 5 anni per la Niemann-Pick; anche decine di anni per altre): stress e impegno economico per la famiglia e lavoro, odissea diagnostica, rischio di ricorrenza. Attenzione ed informazione dei sanitari possono non essere sufficienti. Come fare allora? Inserimento delle malattie LSD nello screening neonatale, ma con possibili risultati positivi che potrebbero rimanere asintomatici per anni, anche dopo l’età infantile, con stress dei genitori e, includendo le procedure di controllo e counseling, potrebbero essere più costose del singolo test sui bambini sintomatici. Una soluzione migliore potrebbe essere lo screening genetico della popolazione per l’identificazione dei portatori sani (come adottato per la sua frequenza per la m. Tay-Sachs negli ebrei ashkenaziti)(vedi bellissimo articolo nella selezione Articoli dell’Agosto 2016: Expanded carrier screening: A review of early implementation and literature. Seminars in Perinatology 2016;40:29).
Screening: Baby’s first test: Pg. 162. It is time for a rethink on screening newborns. Infatti è possibile per una buona parte delle LSD, ma questo andrebbe contro i principi stabiliti per lo screening neonatale 50 anni fa (WHO, m. gravi e curabili ed economicamente conveniente), anche se ora alcune esigenze etiche spingono per rivederli. Le obiezioni riguardano soprattutto il fatto che alcune patologie si possono presentare a varie età e potrebbero addirittura rimanere asintomatiche ed eventuali trattamenti dannosi e che in alcuni la diagnosi potrebbe dubbia. Ma altri sostengono che oltre ai benefici a ogni età per che ne è affetto ci sono vantaggi per le conoscenze che in prospettiva porteranno migliori cure per queste malattie. Segue la storia degli screening neonatali con esempi (m. Krabbe). Il problema del consenso informato e un commento (che mi pare azzeccato anche per altri screening come le vaccinazioni, ndr) “To give parents the option of opting in for something they don’t really know anything about, I think it’s dangerous”. In ogni modo sembra da indagini informative di piccoli gruppi di genitori, che non costituiscono certo la realtà per la scarsa numerosità e per come sono state condotte, sembra che la maggior parte di loro acconsentirebbe.
Drug development: Through the barrier. 154. Treatments need to get to the brain. In molte di queste malattie con una sintomatologia neurologica devastante dobbiamo potere superare con farmaci la barriera emato-encefalica. 1. Terapia sostitutiva enzimatica è disponibile per le m. Gaucher 1, Fabry, Pompe, quattro mucopolisaccaridosi e deficit di lipasi acida, mentre sono in preparazione terapie per la MPS VII e una forma di Niemann-Pick. Ma non passa la barriera ed è costosa con somministrazione e.v. per tutta la vita. 2. Riduzione del substrato, le molecole che per la mutazione non possono essere metabolizzate; tecnica usata per la m. Gaucher e per la m. Niemann-Pick con il miglustat o, meglio, eliglustat per os e, ancora in sperimentazione fase 2, farmaci che inibiscono la sintesi dei glicosfingolipidi per m. Gaucher 1, M. Fabry, Tay-Sachs. 3. Terapia con chaperonine farmacologiche (proteine che guidano il corretto ripiegamento tridimensionale di altre proteine impedendo che si stabilizzano in conformazione inattiva), come migalastat (simile al miglustat), chaperonina inbitoria, che in quanto piccola molecola ha il vantaggio di superare la barriera ma come gli altri ha lo svantaggio di essere mutazione specifico, approvato per una buona proporzione di mutazioni (35-50%) dei pz con m. Fabry. Vi sono però promettenti chaperoni che stimolano chaperonine naturali come le proteine da shock termico, come l’arimoclomol nei confronti di HSP70, in sperimentazione nella ALS e nella Niemann-Pick C in cui nel 95% la mutazione è causa del malripiegamento della proteina importante per il trasporto intracellulare del colesterolo (ora in fase III, 46 pz in Europa e USA, 2 anni). Ed altre possibili terapie complementari. Buone prospettive farmacologiche quindi per alcune LSD.
Gene therapy: A new chapter. Pg S158. Delivering a second treatment revolution. Il primo trapianto di MO è stato applicato nel 1980 a un bambino di 11m con s. Hurler (MPS 1), morto a 33 anni per insufficienza cardiaca, che grazie al trapianto ha potuto avere una vita serena con molti amici e andare al lavoro da McDonalds su una sedia a rotelle. Ora in fase preclinica per questa malattia si sta verificando se sia possibile la terapia genica con vettore virale la cui sperimentazione inizierà nel 2017 condotta dagli stessi ricercatori italiani che hanno messo a punto nel 2010 la terapia genica per la Leucodistrofia metacromatica (che diventerà clinicamente disponibile per tutti i pz nel 2018). Ma sono in sperimentazione in modelli animali di MPS anche altri vettori come i trasposoni. Il problema di questa terapia è che le cellule bersaglio non sono quelle cerebrali, spesso compromesse nelle LSD, anche se per motivi non chiariti vi è comunque con questa terapia un certo miglioramento cognitivo. Ma l’ostacolo potrebbe essere evitato iniettando con un vettore adenovirale particolare che se iniettato nel liquido cefalorachidiano nell’animale si diffonde anche ai neuroni. Sono anche programmate nel 2017 sperimentazioni cliniche in fase I-III per altre LSD come la MPS 3A. E in fase I/II è in corso in USA una sperimentazione per la MPS 1 con l’editing genico CRISPR–Cas9. Un ricercatore commenta: “I hate to use the word ‘cure’ until the data are in, but what we have is the closest I’ve ever seen”.
Advocay. Strong foundations. Pg. S152. How parent power can aid the development of drugs for rare diseases. La maggior parte delle LSD non hanno una terapia specifica che sia stata approvata dalla FDA/EMA. Le fondazioni dei pz e dei loro familiari spingono fortemente per sviluppare la ricerca su queste malattie orfane e premono perché le regolamentazioni per lo sviluppo dei farmaci siano semplificate eliminando la complessa burocrazia presente stimolando così le case farmaceutiche a provare nuovi farmaci da mettere sul mercato. E in qualche caso anche intervenendo economicamente. Ne vengono portati esempi e sottolineato il fatto che conoscendo poco la storia naturale di malattie così rare sia difficile valutare gli effetti di un farmaco in sperimentazione; una soluzione possibile è quella di non porsi come obiettivo principale della ricerca un dato clinico ma un biomarcatore.
Perspective: Finding common ground. S160. Due malattie: la m. Gaucher e il Parkinson. Il malripiegamento della glucocerebrosidasi, enzima carente nella prima, sembra contribuire al Parkinson facendo aumentare l’aggreazione della α-sinucleina o interferendo con la sua eliminazione.
Reserach: 4 big questions. Pg. S165. Cosa è importante, perché e le attuali strategie adottate:
1.        How can the neurological deficits associated with LSDs be treated?
2.       What is the relationship between LSDs and other neurodegenerative diseases?
3.        What is the lysosome’s role as a mediator of cellular signalling?
4.       How can the design of clinical trials be improved to accelerate drug development for ultra-rare LSDs? Importanza: difficile porre degli obiettivi terapeutici data la bassa frequenza delle malattie (e quindi il ridotto numero di pz reclutabili) e le scarse conoscenze del fenotipo e della sua storia naturale. Perché: molte LSD potenzialmente fatali si osservano in< 1:100.000 nati. Strategie: in assenza di biomarcatori ci si è basati, con il consenso della FDA, sulla clinica come la riduzione di volume del fegato e milza per la sperimentazione con un ricombinante della glucocerebosidasi (taliglucerasi alfa).

Lentiviral vectors, two decades later. Science 2016;353:1101 (primo A italiano). A deadly virus became an effective gene delivery tool. Storia di lunghe ricerche che in 20 anni hanno portato a trasformare un virus ad alta morbilità e mortalità in uno strumento di cura per persone con gravi malattie debilitanti.

Off the grid. Nature Biotechnology 2016;34:891. Traduzione a braccio: terapie non connesse, come quelle delle cellule staminali che millantando effetti spettacolosi sono cresciute nel privato molto rapidamente (in USA ci sono 351 “stem cell businesses” in 570 sedi diverse vs le 100 cliniche di un paio di anni fa)(Cell Stem Cell 2016;19:154), ma che richiedono serrati controlli della loro applicazione e del loro esito anche a distanza.

CREBRF variant increases obesity risk and protects against diabetes in Samoans. Nature Genetics 2016;48:976. Commento di un articolo (A thrifty – che fa risparmiare- variant in CREBRF strongly influences body mass index in Samoans. Pg. 1049) in cui viene identificata prima con GWAS e poi con sequenziamento mirato nella popolazione delle isole Samoa (Polinesia) una variante (p.Arg457Gln) del gene CREBRF (regolatore negativo della risposta allo stress del reticolo endopasmatico e della risposta alle proteine non ripiegate) significativamente associata ad un alto BMI (rischio 1.5 volte) e a diabete m. 2 (rischio 1.6 volte), molto frequente in questa popolazione e molto rara nella popolazione USA, che nei modelli cellulari di adipociti promuove l’accumulo di grasso e riduce il consumo di energia. In questa popolazione Samoa l’obesità interessa più della metà della popolazione (vs 1/3 della popolazione USA), in parte dovuta alla modernizzazione ma in parte già presente prima. Interessante anche il fatto che c’è evidenza di una selezione positiva per questa variante, che non sembra promuovere le comorbilità associate all’obesità.

Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience 2016;17:537. Nel SNC, non solo embrionale ma anche nell’adulto, vi è una continua proliferazione di cellule staminali neurali che formano sia i neuroni che le cellule gliali in un processo strettamente regolato e controllato dall’epigenetica tramite modificazioni istoniche e regolazione da parte di RNA non codificante che contribuiscono alle varie tappe della neurogenesi. Si capisce quindi perché alterazioni epigenetiche sono alla base di varie malattie cerebrali. Una buona parte di questa review (con belle figure, da lezione, ndr) è dedicata a tali meccanismi, al ruolo dei microRNA (piccole molecole endogene di RNA non codificante a singolo filamento) e dell’RNA non codificante (lncRNA), dei processi di metilazione e demetilazione del DNA e istonici nella neurogenesi. E del coinvolgimento in questi processi dei geni delle malattie neurodegenerativa (Alzheimer, Parkinson, Huntington) e nelle malattie psichiatriche (Depressione maggiore, Schizofrenia). Questo grazie a “The rapid development of novel techniques, such as new next-generation high-throughput sequencing technologies, genomic editing and human brain organoid cultures” che ci offrono “opportunities to decipher brain development and functions”.

Adhesion G protein-coupled receptors in nervous system development and disease. Nature Reviews Neuroscience 2016;17:550. In questa review vengono presentate le implicazioni fisiopatologiche del ruolo cruciale svolto dai membri della famiglia dei recettori di adesione accoppiati al proteine G (aGPCR) nello sviluppo del SN. Le patologie associate (Tab. 1: elencati 6 geni OMIM tra cui suscettibilità a difetti del tubo neurale, 2 forme di Polimicrogiria, s. Contrattura congenita letale 9, Usher IIC e due SNP, uno legato alla schizofrenia e uno a ADHD).

CLINICAL TRIALS
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Incentives for Clinical Trialists to Share Data. NEJM 2016;375:1112. La condivisione dei dati delle sperimentazioni cliniche è di beneficio per i pazienti perché consente di condurre studi di meta-analisi, di confermare risultati già pubblicati e quindi la messa a punto di nuove terapie. Vengono presentati esempi di implementazione di condivisione dati da parte di EMA di compagnie farmaceutiche ed organizzazioni che finanziano le sperimentazioni (es. Fondazione Gates). Ma comprensibilmente alcune gruppi di ricerca universitari temono che la condivisione prematura dei dati avvantaggi ricercatori esterni che non hanno collaborato alla ricerca danneggiando coloro che invece hanno contribuito a portarla avanti. Ma i sostenitori della condivisione obiettano che i risultati di molte sperimentazioni non sono mai stati pubblicati impedendo ad esempio di condurre analisi secondarie: di questo ne viene portato un chiaro esempio. Come stimolare la condivisone dei dati? Prevedendo per questo appositi finanziamenti, incentivi per i ricercatori che forniscono dati in termini di riconoscimento del loro lavoro o incentivi accademici, pubblicazioni e che venga posto come uno dei criteri di finanziamento. Insomma ci si deve mettere nella condizione di considerare la condivisione dei dati delle sperimentazioni non un “gioco a somma zero”, ma rendere coloro che fanno sperimentazione e coloro che usano i dati acquisiti (ricercatori secondari) dei collaboratori, non degli antagonisti, diventando così coautori di pubblicazioni. In altre parole è necessario cambiare sistema e fare in modo che chi fa sperimentazione e lo sponsor della ricerca non abbiamo l’esclusiva del controllo a lungo termine delle analisi secondarie.

Clinical Trials, Healthy Controls, and the Birth of the IRB. NEJM 2016;375:1013. La storia delle sperimentazioni cliniche dal 1950 ad oggi.

US to impose tougher rules on reporting clinical trial data. BMJ 2016;354:i5060. A chi conduce sperimentazioni cliniche in USA verrà chiesto al momento della registrazione di fornire informazioni più dettagliate sulla ricerca che vogliono condurre e risultati dettagliati sui risultati al completamento della sperimentazione seguendo due direttive che ora vengono proposte (ClinicalTrials.gov website at https://prsinfo.clinicaltrials.gov). Le nuove regole verranno applicate dal 18 Gennaio 2017 e i ricercatori avranno 90 giorni per rispettarle. Questo, commenta il Direttore di NIH, “will help maximize the value of clinical trials and fulfill researchers’ commitment to trial participants. Access to more information about clinical trials is good for patients, the public, and science”.

European drug agency to appeal ruling that it stop releasing trial data. BMJ 2016;354:i5331. The European Medicines Agency is at loggerheads (ai ferri corti) with the EU General court (che fa parte della Corte di giustizia europea) over the disclosure of trial data. Da parte della corte è stato emanato un ordine provvisorio di proibizione di rendere noti i risultati di uno studio clinico degli effetti di Ataluren (della PTC Therapeutics) in pz con Duchenne e di tre rapporti tossicologici di un farmaco, Fluralaner (MSD Animal Health) per l’infestazione da zecche e pulci nei cani. La richiesta di conoscere i risultati provenivano da compagnie concorrenti, ma Traslarna e Bravecto, che ne hanno il brevetto, si sono opposte. Il giudice ha deciso quindi di non rendere noti i risultati. Ma EMA ha fatto appello perché la decisione del giudice va contro le regole della trasparenza, particolarmente raccomandabile in questo ambito.

Placebo controls in clinical trials: concerns about use in relapse prevention studies in schizophrenia. British Medical Journal 2016;354:i4728. Il caso del ricorso a farmaci antipsicotici per il controllo delle ricadute nella schizofrenia. Ci si pone il problema se sia giusto continuare nella sperimentazione con il ricorso al placebo che comporta alto rischio di ricadute, quando si sa che il trattamento è efficace e che non risulta avere effetti particolarmente dannosi. EMA e FDA sono per proseguire nelle sperimentazioni con il placebo e i medici ricercatori coinvolti nella sperimentazione possono avere un conflitto di interessi tra il bene dei loro pz e i risultati della ricerca e in alcuni casi anche incentivi economici da parte dell’industria farmaceutica. Molti pro e molti contro quindi. Tra i pro si sostiene che l’evidenza empirica dice che non vi sia un aumento di rischio di gravi danni o di morbilità di lungo termine sull’uso di placebo, ma questo articolo conclude dicendo che i dati della letteratura sui possibili danni di sospendere il trattamento sono del tutto inadeguati e che “no evidence of harm is different from evidence of no harm, and the burden must be to show no harm”.

TERAPIA FARMACOLOGICA/GENICA E GENE EDITING
Applications of CRISPR technologies in research and beyond. Nature Biotechnology 2016;34:933. Review su una tecnologia che viene usata come terapia per le malattie genetiche del bestiame e nei modelli animali e in agricoltura, e che verrà presto adottata per la terapia di malattie oculari e del sangue nell’uomo. Sono infatti già in corso due sperimentazioni cliniche per la cura del cancro nell’uomo, una in Cina e una in USA. Ma il ricorso a tale tecnologia è già in avanzato stato di realizzazione per la riproduzione del bestiame, la produzione di nuovi farmaci e per il controllo degli insetti che trasmettono le malattie.

New gene editing technique CRISPR-Cas9 raises important ethical questions, says advisory body. BMJ 2016;354:i5318. Il UK Nuffield Council on Bioethics ha preparato un documento (http://nuffieldbioethics.org/project/genome-editing/) che riconosce che la tecnica del genome editing rivoluzionerà la ricerca biomedica ma l’applicazione della tecnica CRIPSR-Cas9, semplice ed economica che consentirebbe la sua applicazione clinica, pone problemi etici e morali che vanno risolti, come quello della trasmissione alle future generazioni dei cambiamenti prodotti nel genoma. Il comitato di bioetica ha creato due gruppi di lavoro su riproduzione umana e sugli aspetti relativi all’agricoltura.

Approved drugs are to be studied for use in Alzheimer’s disease. BMJ 2016;354:i5063. L’Alzheimer’s
Drug Discovery Foundation sostiene che vi sono molti farmaci, approvati dalla FDA, che potrebbero essere riproposti o usati off label per la cura dell’Alzheimer. Alla conferenza stampa della Fondazione dello scorso 13 Settembre sono state presentati due farmaci Tadalafil, approvato per la disfunzione erettile e il Levetiracetam (Keppra), approvato da tempo per l’epilessia, che potrebbero entrare in sperimentazione per l’Alzheimer. Il primo è in sperimentazione randomizzata per una patologia dei piccoli vasi cerebrali senza deficit cognitivo; il farmaco passa la barriera e dovrebbe migliorare l’irrorazione cerebrale, azione che potrebbe risultare utile anche nell’Alzheimer. Il secondo farmaco viene usato in una piccola sperimentazione di persone con lieve deficit cognitivo, uno dei primi segni dell’Alzheimer che inizia con perdita di memoria. I ricercatori di questa sperimentazione programmano un’altra sperimentazione in fase 3 sempre con lo stesso farmaco e a dosaggi più bassi rispetto a quelli usati nel trattamento dell’epilessia.
Oltre a questi 2 farmaci la Fondazione sta sponsorizzando la sperimentazione di altri 16 farmaci, molte di queste sono sperimentazioni multicentriche ed internazionali.

Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell 2016;167:233. Nei mammiferi la metilazione del DNA è un meccanismo epigenetico fondamentale per organizzare in molti processi biologici l’espressione genica. In questo lavoro si dimostra che nel topo è possibile modificare la metilazione del DNA rendendo così possibile eseguire studi funzionali di regolazione epigenetica.

A genome-editing strategy to treat β-hemoglobinopathies that recapitulates a mutation associated with a benign genetic condition. Nature Medicine 2016;22:987. Sappiamo che mutazioni della subunità β del gene emoglobinico comportano sostanzialmente due malattie (Falcemia, β-talassemia) a comparsa postnatale, dopo che l’espressione della γ globina dei due geni paraloghi (HBG1 e HBG2) si riduce ed aumenta quella della β globina adulta, determinando il passaggio da HbF α2γ2 alla HbA (α2β2). Sappiamo anche che vi sono condizioni patologiche in cui rimane elevata l’espressione della HbF, come nel caso della persistenza ereditaria dell’HbF (HPFH), dovuta a delezioni o sostituzione mucleotidiche che interessano regioni del locus β-globinico che regolano la trascrizione. Nel caso di coesistenza di HPFH e Falcemia o β-talassemia la sintomatologia clinica di queste due ultime è attenuata. Il ricorso all’editing genomico CRISPR con mutazione provocata nei promotori di GBG1 e HBG2, che simula quanto avviene nella HPFH, nelle cellule progenitrici dei globuli rossi porta ad un aumento dei valori di HbF in queste cellule a tale punto da inibire l’ipossia causata dall’anomala morfologia eritrocitaria. Ottima prospettiva terapeutica per una malattia frequente in alcune popolazioni e ad alta morbilità e mortalità infantile.

High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science 2016;353:1545. Il genoma non codificante è coinvolto nella regolazione genica e nelle malattie, ma non abbiamo gli strumenti idonei per l’identificazione e la manipolazione degli elementi non codificanti. In questo lavoro è stato effettuato uno screening CRISPR di regioni adiacenti 3 geni, NF1 NF2 e CUL3, che sono coinvolti nella resistenza all’inibitore di BRAF nel melanoma. In vitro con tale tecnica si dimostra che la dissezione sistematica di loci non codificanti è in grado di identificare elementi funzionali coinvolti nella regolazione genica e nella resistenza a farmaci oncologici. L’applicazione di questa tecnica rende possibile sottoporre a screening varie regioni del genoma per ottenere informazioni sulle relative funzioni.

Splicing solutions: Companies explore new techniques to fix splicing errors. Nature 2016;22:967. New Feature su iniziative delle case farmaceutiche per correggere gli errori di splicing causa di malattie genetiche (ne sono note almeno 18). Come la terapia con Eteplirsen della Sarepta Therapeutics che è stata in sperimentazione per gli ultimi 4 anni per la cura del Duchenne e i cui risultati sono stati ora inviati alla FDA per l’approvazione. Nello studio pilota infatti i pz trattati sono stati in grado di camminare per 196 metri in 6 minuti vs i 162 metri dei non trattati ed avevano una significativa produzione a livello muscolare di distrofina. Il farmaco è un oligonucleotide antisenso che tramite skipping esonico (esome 51 dove sono localizzate parte delle mutazioni del DMD) favorisce la formazione di una proteina più corta ma funzionante (come se il pz avesse la s. Beker). Ma la FDA ha ritenuto opportuno non convalidare la procedura d’urgenza di approvazione per mancanza di dati clinici sufficienti. Ne risentiremo parlare. Altra patologia suscettibile di terapia sempre intervenendo sullo splicing è la SMA in cui è usato un oligonucleotide che si lega in una specifica sede del mRNA. Sempre per la SMA la casa farmaceutica Ionis Pharmaceuticals and Biogen ha annunciato che per gli ottimi risultati ottenuti nella sperimentazione con Nusinersen (oligonucelotide antisenso) abolirà il braccio del placebo (il farmaco riattiva con un meccanismo di splicing il gene backup SMN2)(A splicing magic bullet. Science 2014;345:624)(Selezione articoli Agosto 2014). Sinora la FDA ha approvato la terapia con oligonucleotidi antisenso per una forma di retinite da CMV (fomivirsen) e per ridurre la colesterolemia (Mipomersen).
Ma ci sono nuovi approcci terapeutici che operano sugli enzimi dello splicing e non sul mRNA, altri con il ricorso a piccole molecole chiamate modulatrici dello splicing che si legano direttamente allo spliceosoma, un complesso enzimatico di proteine e piccole molecole di RNA nucleare. Una di queste della Roche ha dimostrato in fase 2 di pz con SMA di aumentare la produzione di proteina SMN, ma la sperimentazione è stata bloccata nel 2015 per la comparsa nell’animale da esperimento (scimmia) di una patologia oculare. Quindi ci sono terapie promettenti per queste patologie (vedi tabella di alcune malattie con le caratteristiche cliniche ed epidemiologiche da errori di splicing e la tabella delle terapie approvate ed attualmente in sperimentazione).

Danazol Treatment for Telomere Diseases. NEJM 2016;375:1095. Lettera che commenta un articolo (Danazol Treatment for Telomere Diseases. NEJM 2016;374:1922)(selezione articoli Maggio 2016) sui risultati di una sperimentazione clinica (NCT01441037) e del successo della terapia con un androgeno sintetico (Danazolo) che comporta un allungamento dei telomeri e significativi benefici clinici di pz con mutazione di geni responsabili del mantenimento e riparazione telomerica. L’A della lettera chiede quali possano essere i meccanismi di azione dell’androgeno, che non sembrano chiari, e se ci sono dati sulla capacità vitale forzata polmonare (FVC), che dovrebbe costituire un obiettivo primario per pz con fibrosi polmonare. Nella risposta gli AA spiegano possibili meccanismi dell’androgeno e, riconoscendo l’appropriatezza della critica, presentano i loro risultati, sottolineando che per loro questo era un obiettivo secondario della sperimentazione anche perché è difficile valutare efficacemente la riduzione della funzione polmonare. I loro dati, con la limitazione del fatto che il loro studio non aveva tale obiettivo, sembrano confermare che nei non trattati vi è una certa riduzione di FVC rispetto ai trattati.

Using DNA, radiation therapy gets personal. Science 2016;353:1348. NEWS: Gene-based tests aim to
predict who will benefit from radiation, or suffer. Comunicazione al meeting annuale della American Society for Radiation Oncology (ASTRO): ricercatori stanno studiando i profili genetici tumorali che aiutano a sapere se quel tumore è o meno suscettibile alla radioterapia, e stanno studiando anche se varianti di sequenza DNA possono dirci se una persona avrà o meno importanti e permanenti effetti collaterali a tale trattamento, come difficoltà di deglutizione, perdita di memoria, impotenza o incontinenza. Sinora si è puntato sulla precisione e sul dosaggio, ora si punta sulla biologia, dice il commento.

Cystic fibrosis foundation opens drug discovery lab. Science 2016;353:1194. La Cystic Fibrosis Foundation, che ha contribuito a preparare due nuovi farmaci per la FC (uno Orkambi per la F508del e Kalydeco per mutazoni più rare che in totale sono usabili per la metà dei pz)(vedi figura), il 19 Settembre 2016 ha aperto un laboratorio indipendente in Lexington (Massachusets) dedicato alla ricerca di un farmaco efficace per la cura di questa frequente malattia, che ancora è causa morte prematura. La motivazione di avere un proprio lab. risiede nel fatto che vuole evitare le lunghe procedure burocratiche, legali e di proprietà intellettuale che impediscono a laboratori universitari finanziati dalla Fondazione stessa di procedere speditamente alla ricerca di nuove terapie. Il nuovo lab. impiega 23 ricercatori e ne sono stati programmati altrettanti per il prossimo futuro. Parte dei fondi per il nuovo lab. provengono dalla vendita del brevetto di Orkambi e Kalydeco. La Fondazione nello stesso tempo non vuole spingere i laboratori universitari a disinteressarsi della ricerca di nuovi farmaci per la FC e dichiara che “We don’t care who’s successful. We want success” (comprensibile per una Fondazione, ndr).

MODELLI ANIMALI/IN VITRO
Dietary protection for genes. Nature 2016;537:316. Commento di un articolo sullo stesso fascicolo in cui, partendo da quanto si sa dal punto di vista sia epidemiologico che sperimentale sul prolungamento del periodo di vita associato a restrizione dietetica, si dimostra che in due modelli murini da difetto della riparazione del DNA (riparazione per scissione di nucleotidi, NER) una modesta restrizione calorica (30%) riduce il danno del DNA ed aumenta la durata della loro vita (Restricted diet delays accelerated ageing and genomic stress in DNA-repair-deficient mice. Pg. 527). Si era osservato infatti che topi con mutazione Ercc1 presentavano risposte metaboliche allo stress simili a quelle dei topi in restrizione alimentare e in ambedue si osservava una maggior attività dei pathway biologici coinvolti nella manutenzione a spese di quelli della crescita. Questo viene considerato come una risposta di sopravvivenza che aiuta a proteggere i topi con deficit di NER. Sono stati utilizzati in questi sperimenti ceppi con mutazione di Ercc1, la cui proteina forma un complesso con una endonuncleasi per tagliare le sequenze di DNA danneggiate, che sono causa di patologia umana (s. Cockayne B – in OMIM è il gene ERCC6 ad essere mutato, ndr-, la s. Progeroide XFE -in realtà in OMIM è il gene ERCC4 ad essere mutato, ndr, e lo Xeroderma Pigmentoso gruppo G/Cockayne – in realtà è il gene ERCC5 ad essere mutato, ndr) e ceppi con mutazione di un’altra endonucleasi, XPG (Xeroderma Pigmentoso gruppo G/Cockayne – e la s. Cerebro-oculo-facio-scheletrica 3, ndr). Oltre al prolungamento della vita (nei maschi da 10 a 35 settimane nelle femmine da 13 a 39 settimane), alcuni interessanti risultati: i topi mutanti in restrizione alimentare hanno conservato il 50% in più di neuroni rispetto a quelli mutati in dieta libera, i marcatori di danno del DNA sono ridotti nei trattati e sono meglio conservati i profili trascrizionali, nei topi mutati in dieta libera sono maggiormente colpiti i geni codificanti proteine di grandi dimensioni, che sono più probabilmente interessati da mutazioni casuali.
Il peso dei topi con difetto di NER in dieta libera diminuisce con il tempo e muoiono con un peso simile a quelli sempre con difetto NER ma in dieta ristretta, nei primi il calo ponderale è dovuto al declino fisiologico nei secondi invece ad un aumentato processo fisiologico. Almeno in parte l’effetto sul prolungamento della vita nei topi mutanti in dieta ristretta è dovuto ad un’inibizione dei pathway IGF1 e mTOR. Opportunamente il commento sottolinea che il ricorso alla rapamicina, un inibitore del segnale mTOR, riduce l’accumulo di DNA danneggiato in una sindrome con instabilità genomica, la s. Werner, e nei topi con mancanza di una proteina mitocondriale, Ndhfs4 che è necessaria per la produzione di energia, il ricorso a questo farmaco triplica la loro durata di vita. Quindi è aperta la via per sperimentazioni cliniche in pz con sindromi progerodi con difetto di riparazione del DNA di lieve restrizione calorica e/o di ricorso ad inibitori mTOR.

Immune receptor for pathogenic a-synuclein. Science 2016;353:1498. Commento di un lavoro (Pathological α-synuclein transmission initiated by binding lymphocyte-activation gene 3. Pg. 1513) i cui risultati possono chiarire un aspetto patogenetico significativo del Parkinson costituito dalla trasmissione da un neurone all’altro di fibrille malripiegate (PFF) di α-sinucleina. Si dimostra in vitro e in vivo (topo transgenico) che LAG3 (gene di attivazione linfocitaria 3, della superfamiglia delle immunoglobuline) lega con alta affinità PFF di α-sinucleina, non il suo monomero, legame che attiva l’endocitosi di PFF α-sin, la trasmissione e la sua tossicità. La mancanza di LAG3 nel topo rallenta significativamente la perdita di neuroni dopaminergici da PFF α-sin e le anomalie biochimiche e comportamentali. Quindi LAG3 potrebbe costituire un bersaglio per nuove terapie di questa e di altre α-sinucleinopatie.

CARATTERI-MALATTIE COMPLESSE/STUDI ASSOCIAZIONE
Treasure hunt in a minefield — exploring migraine with GWAS. Nature Reviews Neurology September 2016 (News & Views). Si commenta l’articolo Meta-analysis of 375,000 individuals identifies 38 susceptibility loci for migraine. Nature Genetics 2016;48:856 (vedi selezione articoli Agosto 2016) concludendo che “The study implicates several new loci in migraine — many of them suggestive of vascular pathophysiology — but the functional relevance of many now-detected risk alleles remains elusive”.

Identification of 15 genetic loci associated with risk of major depression in individuals of European descent. Nature Genetics 2016;48:1031. Studiate 75.607 persone con depressione e 231.747 che riferiscono di non esserne affetti con l’individuazione di 5 varianti indipendenti in 4 regioni. In una successiva meta-analisi di altri campioni (affetti e controlli) identificate in totale 17 SNP indipendenti di 15 regioni. Alcuni di questi loci sono in comune con meta-analisi di pz psichiatrici.

Variation in the glucose transporter gene SLC2A2 is associated with glycemic response to metformin. Nature Genetics 2016;48:1055. Nonostante la Metformina sia il principale farmaco antidiabetico in uso non ne conosciamo bene il meccanismo di azione. In questo lavoro del Metformin Genetics (MetGen) Consortium uno studio di 13.123 partecipanti di differente provenienza geografica/etnia si è individuato l’allele C di rs8192675 in un introne di SLC2A2, gene che codifica il facilitatore del trasporto del glucosio GLUT2, associato ad un aumento di riduzione della HbA1c (Hb glicata) in persone di derivazione europea. In base a risultati ottenuti si ritiene che lo SNP partecipi alla regolazione a livello epatico dell’azione della Metformina. Tra le persone con obesità gli omozigoti per l’allele C in rs8192675 hanno una riduzione assoluta di Hb glicata maggiore rispetto agli omozigoti per l’allele T. La stima dell’effetto dell’allele è di ridurre la Hb glicata dello 0.15%, con un impatto farmacologico di una dose pari a 250mg al giorno del farmaco corrispondente al 26% della dose giornaliera. Con un effetto più rilevante per gli obesi e con il suggerimento clinico pratico che rs8192675 potrebbe essere un biomarcatore per la medicina stratificata (parte della medicina personalizzata in cui si individuano sottogruppi di pz che differiscono per meccanismi di malattia, sensibilità a una malattia o a un farmaco)(https://www.eupati.eu/it/glossary/medicina-stratificata/).