Articoli Genetica Clinica/Umana Ottobre 2014. R. Tenconi

Scelta di articoli di Genetica Clinica/Umana pubblicati in Ottobre 2014 nelle seguenti riviste: British Medical Journal, Lancet, Lancet Neurology, Nature, Nature Biotechnology, Nature Genetics, Nature Medicine, Nature Neuroscience, Nature Reviews Genetics, Nature Reviews Neuroscience, NEJM, PNAS, Science & Cell.

ARTICOLI DA NON PERDERE

Reaching a CNV milestone. Nature Genetics 2014;46:1046. Commento dell’articolo (Refining analyses of copy number variation identifies specific genes associated with developmental delay. Pg. 1063)(molti AA italiani)(“impresa erculea” dice il Commento) che presenta i risultati di una combinazione tra analisi delle CNV (copy number variant) e SNV (single nucleotide variant) in pz con deficit cognitivo o autismo o altre patologie neurologiche e in controlli. Questo lavoro rende più agevole il compito, talora difficile, di distinguere una CNV patogena da un polimorfismo.

Sappiamo, dice il Commento, che una CNV può essere associata a fenotipi diversi e che molte CNV causano lo stesso fenotipo (la cosa non sorprende in Genetica Clinica, ndr) complicando così l’interpretazione clinica del dato. Sappiamo anche che con l’analisi CNV troviamo la causa nel 20-25% di persone con DI e che in alcune condizioni (s. TAR ad es) l’effetto fenotipico di una CNV dipende anche da uno o più geni localizzati nel segmento omologo normale o da una seconda CNV in un altro locus. Sempre nel commento viene proposta una classificazione delle CNV in 5 gruppi in base alla gravità del fenotipo e alla penetranza e le implicazioni sociali (etiche, ndr) dello screening delle CNV di tutte le gravidanze mediante la tecnica prenatale non invasiva.

Nel lavoro è stata costruita una mappa di morbilità per patologie quali il ritardo di sviluppo psichico, disabilità intellettiva o autismo come risorsa per i clinici che devono attribuite la patogenicità delle CNV e per identificare geni sensibili all’effetto dose. Sono state individuate 70 CNV significative analizzando i dati di 29.085 bambini con DI e 19.584 controlli sani.

Questi dati sono stati integrati con quelli pubblicati di sequenziamento esomico e con i dati di sequenziamento tramite NGS di geni candidati di altri 4.716 casi e 2.193 controlli identificando mutazioni patogenetiche di nuovi geni di rilevanza statistica (nel confronto affetti-sani) e anche clinica. In particolare viene confrontato il fenotipo di casi con CNV e casi con mutazione troncante per due geni, SETBP1 e ZMYND11, responsabili rispettivamente della sindrome da microdel 18q12.3 e della sindrome da microdel 10p15.3 (da sottolineare che mutazioni con acquisizione di funzione di SETBP1 causano la s. Schinzel-Giedion). Viene confermato KANSL1 come il gene causa della sindrome da microdel 7q21.31, chiamata sindrome Koolen–de Vries(-Zollino, ndr).

In conclusione l’approccio adottato del genotype-first con l’integrazione dello screening mutazionale CNV-SNV facilita l’individuazione di  nuove sindromi e dei nuovi geni causa delle patologie del neurosviluppo-psichiatriche, che sappiamo hanno una considerevole eterogeneità genetica (da sottolineare anche l’importanza quando si registrano dati di CNV di una precisa analisi del fenotipo non solo comportamentale-cognitivo ma anche quello desunto dall’esame clinico, ndr).

Genome-Scale Sequencing in Clinical Care Establishing Molecular Diagnoses and Measuring Value. JAMA on line 18 October 2014. Editoriale di due articoli sullo stesso fascicolo (Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing e Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders) che commenta i risultati del WES di 2.800 pz, in genere bambini, con varie patologie del SNC e deficit cognitivo. Nel 25% dei casi è stata possibile la diagnosi, con risultati identici ad altri studi nonostante differenze tecniche ed analitiche. Da sottolineare la flessibilità delle piattaforme usate nell’incorporare quasi in tempo reale nell’analisi geni del tutto recentemente considerati geni –malattia.

Ma l’Editoriale pone note di cautela: non conosciamo la sensibilità e la specificità clinica di WES, perché ci sono, ma non sappiamo quanti siano, i falsi positivi (varianti considerate patogene in base alla letteratura che non solo tali, probabilmente pochi), ci sono abbastanza falsi negativi (limiti tecnici) e ci sono sicuramente anche i veri negativi (non genetica), tanto che, dice l’editoriale “Further details about the performance of exome sequencing will be needed as its use as a routine clinical test is contemplated”.

Ma nello stesso tempo si sottolinea l’importanza della diagnosi in medicina, soprattutto per le malattie rare. Diagnosi che consente di rispondere alle classiche 5 domande che ognuno, pz e clinici, si pongono (e che sono una parte essenziale della consulenza genetica, ndr): (1) What is the diagnosis? (2) How did it happen? (3) Who else in the family might be at risk? (4) What can be expected in the future? (5) Is there any treatment or cure?

Viene infine sottolineata la necessità di un counseling attento, di un consenso all’esecuzione WEB ben informato dei benefici e dei rischi che possono derivarne e di una comunicazione del risultato chiara e non frettolosa.

Use of Whole-Exome Sequencing to Determine the Genetic Basis of Multiple Mitochondrial Respiratory Chain Complex Deficiencies. JAMA 2014;312:68. Le patologie della catena respiratoria mitocondriale sono una comune (1:5.000 nati vivi) causa di malattia neurometabolica pediatrica e dell’adulto, malattie che, con poche eccezioni, sono difficili clinicamente da ipotizzare tanto che spesso il suggerimento diagnostico sorge sulla base di un approccio multidisciplinare e necessita comunque per la conferma esami biochimici costosi, complessi ed invasivi (biopsia di tessuto o di organo). Sono pochi i pz con mutazione del mtDNA e sono sempre di più i geni nucleari di malattia; per questo l’approccio diagnostico oltre che costoso è anche molto complesso e questo fa ritardare la diagnosi, la terapia ed il counseling genetico. Lo studio (53 pz con diagnosi biochimica di difetto multiplo del complesso della catena respiratoria senza mutazione primaria di mtDNA) si propone di verificare se il ricorso al WES può essere utile per la diagnosi in questi pz.

La risposta, scontata, è sì: in 28 pz (53%) identificate varianti causative e in altri pz (8%) possibili varianti causative di 18 geni per un totale del 60% (IC al 95%=46%-74%). Alcune mutazioni sono ricorrenti ma ci sono anche nuove mutazioni in 4 possibili geni malattia mitocondriali (VARS2, GARS, FLAD1, PTCD1). Come era da attendersi in alcuni pz sono presenti segni clinici atipici.

In conclusione WES funziona, ma occorrono altri studi e altri casi per concludere che l’approccio diagnostico con WES è preferibile a quello tradizionale.

MALATTIE NEUROLOGICHE/NEURODEGENERATIVE

Bringing forward the diagnosis of Alzheimer’s disease. Lancet Neurology 2014;13:961.

At the crossroads of preclinical AD and normal brain ageing. Lancet Neurology 2014;13:995.

Age-specific population frequencies of cerebral β-amyloidosis and neurodegeneration among people with normal cognitive function aged 50–89 years: a crosssectional study. Pg. 997.

Alla ricerca e all’applicazione clinica di biomarcatori per anticipare la diagnosi per clinical trial e trattamenti più precoci.

Focus on big data. Nature Neuroscience 2014;17:1429. Serie di articoli sui grossi progetti in Neuroscienze, come BRAIN  in USA e Human Brain Mapping in Europa, che porteranno contributi dall’applicazione di NGS, dell’epigenomica, della connettomica e dagli studi funzionali che modificheranno sensibilmente le neuroscienze.

Putting big data to good use in neuroscience. Pg. 1440. 

Big data from small data: data-sharing in the 'long tail' of neuroscience. Pg. 1442.

The big data challenges of connectomics. Pg. 1448.

Big behavioral data: psychology, ethology and the foundations of neuroscience. Pg. 1455

Decoding neural transcriptomes and epigenomes via high-throughput sequencing. Pg. 1463.

Analytical tools and current challenges in the modern era of neuroepigenomics. Pg. 1476.

Decoding neuroproteomics: integrating the genome, translatome and functional anatomy. Pg. 1491.

Dimensionality reduction for large-scale neural recordings. Pg. 1500.

Making big data open: data sharing in neuroimaging. Pg. 1510.

AUTISMO

CHD8 regulates neurodevelopmental pathways associated with autism spectrum disorder in

neural progenitors. PNAS 2014;E4468. L’architettura genetica dell’autismo (ASD) è complessa e molto eterogenea. Sono stati individuati geni che contribuiscono a questa patologia che sono coinvolti nella struttura sinaptica e nella neurotrasmissione glutammatergica, ma sorprendentemente anche geni di pathway meno prevedibili come quelli coinvolti nelle modificazioni cromatiniche, nella metilazione del DNA, nell’adesione cellulare e nella regolazione trascrizionale. Quindi se ci sono così tanti geni dello spettro autistico potrebbe esserci molti pathway che indipendentemente ne causano il fenotipo o che geni funzionalmente distinti possono convergere nell’interessare un numero limitato di pathway causa dello spettro. Si è ricorsi in questo lavoro all’analisi in vitro dell’effetto di una mutazione con perdita di funzione in eterozigosi del gene CHD8 (suppressing chromodomain helicase DNA-binding protein 8), un noto gene altamente penetrante come causa di ASD, in cellule progenitrici neurali umane. L’effetto che si produce è un’alterata espressione diretta di più di 1.700 geni (tra cui i geni di modificazione cromatinica e di regolazione trascrizionale, alcuni geni del cancro) e di un numero ancora maggiore di geni indirettamente (senza siti di legame a CHD8) coinvolti nella formazione di sinapsi, differenziazione neuronale, adesione cellulare e di formazione assonica. Dato interessante: la soppressione di chd8 in vivo (zebrafish) causa macrocefalia, un segno comune dell’ASD. In conclusione la perdita di funzione di CHD8 è responsabile di un’alterata espressione dei pathway del neurosviluppo in cui molti geni ASD convergono alterando comuni meccanismi patogenetici.

Autism spectrum disorder severity reflects the average contribution of de novo and familial influences. PNAS 2014;111:15161. La variabilità fenotipica dello spettro autistico (ASD)(lo spettro indica appunto l’ampia variabilità di presentazione) può essere dovuta alla notevole eterogeneità genetica. Lo studio vuole verificare se il deficit cognitivo e la gravità dei segni clinici sono caratteristiche de novo o riflettono influenze familiari. Studiati > 2.000 casi non familiari di ASD e verificato se vi sia una relazione tra QI, deficit comportamentali e di linguaggio con il numero di mutazioni con perdita di funzione de novo e la storia familiare di malattie psichiatriche (depressione, d. bipolare, schizofrenia, ricoveri in psichiatria). C’è una correlazione negativa tra QI e tasso di mutazioni de novo e una correlazione positiva tra QI e storia familiare di m. psichiatriche, quindi nei casi con grave deficit cognitivo vi è un’alta frequenza di mutazioni de novo e una più bassa frequenza di anamnesi familiare di m. psichiatriche. Viene quindi documentata una forte relazione tra malattie psichiatriche in famiglia nei casi di ASD ad alto funzionamento.

Questi risultati possono essere utili per identificare endofenotipi (caratteri considerati dei fattori di rischio per lo sviluppo della malattia e in qualche caso anche il suo decorso) che favoriscano l’interpretazione dei risultati genetici.

Autism as a disorder of prediction. PNAS 2014;111:15220. Nel lavoro, solo su basi teoriche, si sostiene che molti caratteri autistici possono essere dovuti ad un’alterazione delle capacità predittive. E l’inizio del lavoro ci spiega cosa siano le capacità predittive e cosa succede quanto sono carenti: An essential component of a magical phenomenon is the lack of a discernible cause: An event that we are unable to predict happens “as if by magic…. . if our predictive abilities were somehow to be compromised, then even mundane occurrences in the environment might appear magical”. Una cosa magica se è breve che può anche essere piacevole, ma se si è completamente immersi può soverchiante. Se questo avviene nell’ASD si possono identificarne le strutture neurali responsabili e la loro funzione per disporre di strumenti predittivi utili per il monitoraggio della condizione e per eventuali valutazioni di terapie (ancora endofenotipi, ndr).

GENETICA UMANA/CLINICA

*** Ora il fenotipo della s. LEOPARD è più ampio

LEOPARD syndrome-associated SHP2 mutation confers leanness and protection from diet-induced obesity. PNAS 6 October:E4494. La s. LEOPARD (multiple Lentigines, Electrocardiographic conduction abnormalities, Ocular hypertelorism, Pulmonary stenosis, Abnormal genitalia, Retardation of growth, sensorineural, Deafness)(MIM #151100)(LS), è una rara malattia genetica AR con oltre ai segni su elencati difetti cardiaci, dismorfismo facciale e sordità. Fa parte delle RASopatie, così chiamate perché dovute a mutazione di uno dei geni codificanti del pathway Ras/mitogen-activated protein kinases (MAPK). Oltre l’80% dei pz con LS portano una mutazione missenso in eterozigosi del gene PTPN11 che codifica la tirosin fosfatasi SHP2, che è un essenziale regolatore del pathway su indicato e quindi SHP2 ha un ruolo importante nello sviluppo ma anche nel controllo del metabolismo, di cui si sa poco. Il topo LS (knock-in che porta una delle due mutazioni umane più frequenti) ha una fenotipo “magro” con ridotta adiposità e un miglior metabolismo dei carboidrati con una particolare resistenza alle complicazioni metaboliche e all’obesità in dieta obesogenica (quella degli americani, ndr). Questi topi con ridotta adipogenesi hanno un miglior segnale insulinico, aumentata spesa energetica che sono in parte corretti dall’inibizione di MAPK (non rapamicina). Nell’uomo pz con LS (20/28 pz) con diverse mutazioni di PTPN11 hanno bassi valori di BMI, due di questi sono stati studiati a fondo con la tecnica DXA e analisi biochimiche ed hanno una significativa ridotta adiposità e bassissimi livelli di leptina. Nel lavoro si sottolinea che questi sono dati che vanno confermati studiando altri soggetti ma sono indicativi di un fenotipo “magro” associato alla LS.

Molto interessante soprattutto per chiarire il meccanismo dell’anticipazione.

Whole-genome sequencing analysis of phenotypic heterogeneity and anticipation in Li–Fraumeni

cancer predisposition syndrome. PNAS 2014;111:15497. La s. Li-Fraumeni (MIM #151623), caratterizzata dalla predisposizione a diversi tipi di tumore, è dovuta a mutazione del gene soppressore di tumore TP53. In questa sindrome sembra ci sia un’anticipazione da una generazione all’altra dell’insorgenza dei tumori. Si ipotizzava dovuta all’accumulo di CNV in presenza di aploinsufficienza TP53.

Per trovare la causa delle differenze fenotipiche intergenerazionali sono state studiati casi famigliari di LFS con un’anticipazione dell’insorgenza di cancro nelle due generazioni. In analogia con quanto succede nel modello murino di LFS non c‘è un aumento di CNV nella seconda generazione. Quindi l’anticipazione non è dovuta a instabilità genomica. L’applicazione di analisi WES nella famiglia ha identificato rare SNV (missenso e nonsenso) dal padre, non portatore della mutazione TP53, trasmesse a due figli portatori della mutazione e con cancro precoce, ma non ad altri due sempre portatori che non avevamo ancora avuto il cancro. L’ipotesi che i geni interessati possano essere geni modulatori dell’età di comparsa del cancro nei portatori di mutazione TP53. Situazione analoga in un’altra famiglia con mutazioni de novo in coloro che hanno sviluppato il cancro. Gli AA ipotizzano un modello di regressione genetica che spieghi l’apparente anticipazione causata dalla segregazione mendeliana di varianti rare di suscettibilità o resistenza che modificano la penetranza della mutazione di TP53. Una considerazione pratica: questo modello va testato perché se è valido comporta per i casi di LFS de novo un maggior rischio di sviluppare un cancro in età pediatrica di quanto sinora ritenuto e pone quindi una particolare cautela nel counseling post-test applicato come screening di popolazione.

Sempre di Genetica oncologica: alla domanda del perché il cancro al polmone, la cui diagnosi è solitamente tardiva, è sensibile solo temporaneamente alla terapia c’è la risposta di due lavori che hanno analizzato le mutazioni genetiche presenti in diverse aree del tumore (Spatial and temporal diversity in genomic instability processes defines lung cancer evolution. Science 2014;246:251 e Intratumor heterogeneity in localized lung adenocarcinomas delineated by multiregion sequencing. Science 2014;246:256). La risposta, almeno come ipotesi, è che ogni tumore ha profili mutazionali estremamente diversi nello spazio e nel tempo per cui il breve effetto della terapia è dovuto al fatto che il farmaco distrugge solo una piccola porzione del tumore.

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Geneticists tap human knockouts. Nature;2014;514:548. Nell’ultimo meeting ASHG di San Diego si è discusso dell’opportunità di condurre uno studio collaborativo di larga scala per la ricerca delle mutazioni inattivanti presenti nella popolazione generale e su come queste si riflettono sulla salute delle persone. Sappiamo del topo e del ratto, ma sappiamo anche che gli effetti possono essere diversi, ad es. ci sono almeno 43 geni la cui inattivazione nel topo è letale mentre non lo è nell’uomo.

Sarebbe quindi utile vedere “l’effetto che fa” nella nostra specie. Da studi su piccoli campioni sappiamo che ogni persona ha inattivato almeno un allele di circa 200 geni e ambedue gli alleli di 20 geni. Quando questo succede può essere causa di malattia o apparentemente non avere alcun effetto clinico (vedi selezione articoli Maggio 2014)(The Hunt for Missing Genes. Science 2014; 344:687) o addirittura un effetto protettivo per una data malattia (nei finnici il KO biallelico di LPA protegge dalla malattia coronarica). Il silenziamento del gene PCSK1, che nello zebrafish è letale in epoca embrionale, determina in una donna causalmente identificata un effetto protettivo di malattia coronarica abbassando drasticamente LDL (A gene of rare effect. Nature 2013;496:152)(selezione articoli Aprile 2013). Un’applicazione immediata dello studio dei geni KO nell’uomo potrebbe essere quello di trovare nuovi bersagli terapeutici.

Science Webinar Series. Exomes and the Clinical Research Conundrum: New Approaches to Enhancing the Value of Genomic Data. Science 10 October 2014: 261. Registrazione (senza diapo) del seminario sull’uso dell’analisi esomica sulla ricerca clinica, che sottolinea le opportunità e i problemi che le tecniche NGS pongono e come meglio utilizzare questi nuovi approcci tenendo conto delle necessità di chi fa ricerca clinica. Il primo intervento parte  con il classico comune esempio: pz con potenziale deficit intellettivo e qualche segno dismorfico. Se non c’è altro, senza alcun suggerimento clinico, l’array citogenomico. Se invece arricchiamo la clinica con una malformazione cardiaca e schisi palatina avremmo potuto ricorrere alla FISH 22q11 e trovare la delezione attesa in base alla clinica. Buona parte dei pz che vedono in clinica ha deficit intellettivo, ¼ autismo e un certo numero malformazioni-dismorfismi. Per ridurre al minimo l’odissea diagnostica alla ricerca della causa è meglio cercare di applicare tecniche che guardino all’intero genoma e che ci aiutano a trovare una risposta al quesito diagnostico, che consente di fare prognosi, in alcuni casi suggerire una terapia e di precisare la ricorrenza per l’intera famiglia.

Vengono fatti altri esempi (difficile seguire senza poter vedere le diapo), viene sottolineata la necessità di fare un’accurata selezione dei pz e viene suggerita un condivisibile algoritmo diagnostico: 1. pz con fenotipo che indica un gene da testare; se negativo WES o WGS; 2. fenotipo compatibile con un gruppo geni mutati: targeted. Se negativo ricorrere al WES (o WGS); 3. fenotipo aspecifico che si ritiene su base genetica ma che non è sufficiente per testare uno o più geni: WES.

Il secondo intervento è tecnico e parla di piattaforme (Ion AmpliSeq Exome) di 25,000 geni con copertura >10x per il 90% mentre solo il 2% di regioni codificanti non lo sono. Il tornaround time è di 3-6 settimane (!!! Ndr). Hanno anche una piattaforma per le neurologia pediatrica di 614 geni (ClariFocus Exome), che può essere suddiviso in 6 diverse categorie fenotipiche: neuromuscolari, disordini del movimento, epilessia o convulsioni, malformazioni cerebrali, neuropatia periferica ereditaria, leucodistrofia o encefalopatia mitocondriale. La trascrizione dell’incontro termina con le domande, tra cui: se la copertura x10 è sufficiente per una buona validità analitica (si usano nel test due differenti piattaforme), se vi sia capacità di identificare mosaicismi (meglio comunque del Sanger), se si trova una variante nuova qual è la prossima tappa per confermarne la causalità (very robust informatics pipeline come primo strumento e poi il resto). E per i fattori epigenetici si vedrà, si potranno integrare altre tecniche che possono essere applicate in futuro come l’analisi del trascrittoma.

Giant gene banks take on disease. Nature 2014;514:282. Negli ultimi 5 anni c’è stata un’esplosione di sequenziamenti del genoma umano e ci si è resi contro che nessun centro può raccogliere dati sufficienti per associare geni a malattie, ma sono necessari numeri enormi e quindi da qui la necessità di un’ampia collaborazione. Ci sono varie iniziative in questo senso, tra cui una che ha presentato i risultati ottenuti in questi ultimi 2 anni di lavoro allo scorso ESHG meeting a San Diego.

Genetic touch-ups. Nature 2014;514:395. C’è stata una semplificazione delle tecnologie del genome editing (TALENT e CRISPR-Cas) che sono ora meno costose e alla portata anche dei non specialisti. In questo articolo ci sono le istruzioni per chi vuole imparare e farsi un’esperienza pratica, per chi vuol farsi tutto da solo e per chi vuol contattare ricercatori dell’accademia o dell’industria esperti del genome editing.

NLRC4 gets out of control. Nature Genetics 2014;46:1048. Commento di 2 articoli sullo stesso fascicolo (Mutation of NLRC4 causes a syndrome of enterocolitis and autoinflammation. Pg. 1135 e An activating NLRC4 inflammasome mutation causes autoinflammation with recurrent macrophage activation syndrome. Pg. 1140) in cui vengono riportate mutazioni con acquisizione di funzione del gene NLRC4, che in una famiglia con più affetti cosegrega e nella seconda famiglia è de novo con un nuovo fenotipo. Si tratta di una nuova sindrome autoinfiammatoria chiamata NLRC4-MAS (ove MAS è macrophage activation syndrome) a fenotipo molto variabile (come è evidente nella prima famiglia) caratterizzata da febbre ricorrente, sintomi gastrointestinali, aumento dei marcatori infiammatori e aggregazione spontanea di ASC nei macrofagi,). Il gene NLRC4 è un membro della grande famiglia di recettori NOD-like (NLR), che sono sensori intracellulari che interagiscono con l’enzima caspasi-1 e che hanno un ruolo preminente nella difesa antimicrobica contro vari patogeni, tra cui lo pseudomonas aeruginoso e la salmonella typhi.

The Scc2–Scc4 complex acts in sister chromatid cohesion and transcriptional regulation by maintaining nucleosome-free regions. Nature Genetics 2014;46:1147. Il complesso coesinico è composto da SMC1A, SMC3 che appartengono alla famiglia SMC (Structural Maintenance of Chromosome), RAD21 e SA. Ha la funzione di mantenere uniti i cromatidi fratelli durante il ciclo cellulare fino alla loro separazione nelle due cellule figlie. Il complesso della coesina si associa inoltre con proteine accessorie che contribuiscono ad aprire e chiudere l’anello o a stabilizzarne la struttura (NIPBL o SCC4, WAPLl, PDS5A, PDS5B, ESCO1 ed ESCO2)(da Antonio Musio, ndr). Ma la coesina svolge anche un ruolo anche nella regolazione dell'espressione genica, nella stabilità del genoma, nella riparazione del DNA.

Nel lavoro nel lievito si dimostra che il complesso Scc2-Scc4 coopera con il complesso multiproteico RSC (Remodel the Structure of Chromatin) del rimodellamento cromatinico nel mantenere la deplezione nucleosomica nei suoi siti di legame e rendere accessibile il DNA per ulteriori reazioni coesiniche.

Si sono attribuiti gli effetti fenotipici della s. DeLange da mutazione di NIPBL (MIM #122470) al ruolo di mediazione della coesina nelle interazioni cromatiniche che inducono alterazioni trascrizionali, ma il ruolo di Scc4 nel posizionamento nucleosomico e della regolazione trascrizionale potrebbe suggerire un’ipotesi alternativa. Vi è una discreta sovrapposizione fenotipica tra s. DeLange e s. Coffin-Siris (MIM #135900), da mutazione di uno dei geni i cui prodotti sono componenti del complesso RSC, che fa propendere per considerarle più che coesinopatie sindromi nucleosomiche.

Targeted sequencing by proximity ligation for comprehensive variant detection and local haplotyping. Nature Biotechnology 2014;32:1019. Come sappiamo le tecniche genetiche attuali per la diagnosi e la ricerca hanno delle limitazioni nell’individuare tutte le varianti genetiche nei geni di interesse per la focalizzazione solo sugli esoni (e perdendo così varianti di sequenze regolatorie), per le difficoltà presentate da varianti strutturali come le CNV o anche le varianti strutturali bilanciate con punti di rottura che interrompono un gene. La tecnica proposta si basa sul principio del proximity ligation sviluppando la strategia di risequenziamento targeted che consente di risequenziare e costruire aplotipi di geni o di regioni genomiche, da decine e migliaia di kb, e di identificare non solo le SNV ma anche le varianti genetiche strutturali.

A new window into the genetics of complex diseases. Nature Reviews Genetics October 2014. Commento di un articolo (Distribution and Medical Impact of Loss-of-Function Variants in the Finnish Founder Population. PLOS Genetics 2014;10:e1004) che descrive un nuovo approccio nell’identificazione di varianti rare con perdita di funzione con risultati potenzialmente utili per la terapia.

Lo studio sfrutta un fenomeno noto in genetica di popolazione della riduzione della diversità genetica in popolazioni rimaste isolate per centinaia di generazioni, con l’aumento di frequenza di varianti rare rispetto ad altre popolazioni. E l’idea è di verificare le varianti rare con perdita di funzione ottenute da studi genome-wide nella popolazione finnica che ha sperimentato un “collo di bottiglia” 4.000 anni fa e che ha una banca di dati sanitari da molti anni.

L’analisi esomica di 3.000 finlandesi vs 3.000 europei (SUOMI project) ha trovato un numero significativamente più elevato di alleli con mutazioni inattivanti nei finlandesi. Poi sono stati studiati gli effetti su 60 diversi fenotipi di 83 di queste varianti con perdita di funzione in più di 36.000 finlandesi. Sono state trovate due varianti che riducono l’espressione del gene LPA, che codifica la lipoproteina(a), che negli omozigoti o nei composti eterozigoti comportano una riduzione del rischio di malattia coronarica e infarto miocardico acuto; la riduzione di questa lipoproteina ha quindi effetti protettivi per queste comuni malattie complesse.

Questa metodologia potrebbe essere applicata per individuare varianti che contribuiscono ad altri caratteri complessi.

Dysregulation of gene expression as a cause of Cockayne syndrome neurological disease. PNAS 2014;111:14454. La s. Cockayne è una sindrome genetica AR da instabilità genomica (rottura della doppia elica del DNA con possibili conseguenti deleteri riarrangiamenti) con fenotipo caratterizzato da una grave patologia neurologica, deficit di crescita, anomalie di sviluppo, fotosensibilità e patologie degenerative di alcuni organi. E’ geneticamente eterogenea (CSA gene ERCC8, CSB gene ERCC6 gene, XPG/CS gene ERCC5, XPB/CS gene ERCC3, XPF/CS gene ERCC4). La CSB (MIM #133540), che è la più frequente (80% dei pz), è dovuta a un deficit di riparazione del DNA accoppiata alla trascrizione.

In questo lavoro si è studiato nella CSB la connessione tra neuropatologia e sregolazione dell’espressione genica in vitro utilizzando cellule di pz e in un modello murino. Si è osservato con l’analisi del trascrittoma nei fibroblasti umani che anche in assenza di danno del DNA CSB altera l’espressione di migliaia di geni, molti di questi sono geni neuronali. E’ quindi la sregolazione del network genico che determina la neuropatologia, non il difetto di riparazione del DNA.

Aggregation propensities of superoxide dismutase G93 hotspot mutants mirror ALS clinical phenotypes. PNAS 2014;111:E4568. Mutazioni di SOD sono causa della malattia dei motoneuroni Sclerosi Laterale Amiotrofica (ALS). Per capirne il meccanismo patogenetico è stato studiata in questo lavoro l’aggregazione, il legame con i cofattori metallici e la dinamica conformazionale della proteina SOD normale e delle proteine SOD mutate ricorrendo a tecniche biofisiche di diffrazione dei raggi X, di spettrometria di massa e spettroscopia. Si osserva una relazione tra alcuni risultati e gravità clinica in pz con ALS, utile per la prognosi e possibilmente per la terapia mutazione specifica.

CELLULE STAMINALI/MEDICINA RIGENERATIVA

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Disrupted transmission. Nature Reviews Neuroscience October 2014;15. Commento di un lavoro (Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature 2014; doi:10.1038/nature13716) sull’uso di cellule staminali per la comprensione dei meccanismi patogenetici in una famiglia con schizofrenia con una mutazione troncante di DISC1 (disrupted in schizophrenia 1) che cosegrega con la malattia. Il gene è un noto gene-malattia di varie malattie psichiatriche, ma non si sa come la proteina mutante agisca a livello neuronale. Sono state preparate iPSC da un pz con schizofrenia, da un familiare con depressione e da due membri sempre della famiglia senza patologia psichiatrica e senza mutazione. Le iPSC sono state differenziate in cellule progenitrici neurali specifiche frontali e poi in neuroni glutammatergici. A 4 settimane era presente una netta riduzione della densità dei bottoni sinaptici che esprimono un recettore, SV2, che regola il rilascio dei neurotrasmettitori dalle vescicole sinaptiche e i neuroni mutanti presentavano un difetto di trasmissione sinaptica. Con la tecnica del gene editing è stata corretta in una linea cellulare la sequenza mutante ed è stata introdotta la mutazione di DISC in una linea cellulare di controllo. Questo ha corretto il deficit sinaptico nella prima e lo ha indotto nella seconda, provando che il difetto sinaptico è dovuto alla mutazione. Nei neuroni mutanti vi è una sopraregolazione dei geni codificanti le proteine sinaptiche insieme ad una riduzione dei livelli della proteina DISC1.

Questi dati confermano quindi l’ipotesi patogenetica di un deficit di trasmissione sinaptica nella schizofrenia.

First evidence of long term safety of human embryonic stem cells is reported. BMJ 2014;349:6248. Commento di un lavoro (Human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium in patients with age related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy: follow-up of two open label phase 1/2

studies. Lancet October 2014). Successo per la prima volta di una sperimentazione clinica (fase I e II) usando cellule staminali embrionali umane che aveva come primo obiettivo di verificarne in un periodo prolungato la tollerabilità e l’assenza di effetti avversi in 9 pz con distrofia maculare Stargardt e in altrettanti con degenerazione maculare legata all’età. Qualche risultato funzionale comunque in 22 mesi è stato raggiunto: l’acuità visiva è migliorata in 10 occhi ed in 7 è rimasta invariata o migliorata in uno e peggiorata nell’altro. L’occhio di controllo (non trattato) non ha avuto analoghi miglioramenti. Una buona partenza.

GENOME EDITING

Genome editing: a tool for research and therapy.

Bed side to bench: Targeted genome editing hits the clinic. Nature Medicine 2014;20:1101. Commento di due AA italiani sulle potenziali applicazioni del genome editing (vedi Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nature Biotechnology published online, 31 March 2014 doi:10.1038/nbt.2884)(selezione articoli Maggio 2014) nella clinica. Le endonucleasi possono sostituire un gene mutante con uno normale o eliminare ad esempio geni codificanti recettori essenziali per l’ingresso del virus nella cellula per prevenirne l’infezione.

Bench to Bedside: Towards a functional understanding of variants for molecular diagnostics using genome editing. Nature Medicine 2014;20:1103. Commento di come questa tecnica possa essere applicata per produrre mutazioni somatiche associate a malattia nelle line cellulari umane e nei modelli animali per studiarne l’effetto che si produce e quindi fornire utili informazioni funzionali per la diagnosi clinica.

MODELLI ANIMALI

Social learning and amygdala disruptions in Nf1 mice are rescued by blocking p21-activated kinase. Nature Neuroscience 2014;17:1583. Oltre metà delle persone con Neurofibromatosi 1 ha difficoltà di elaborare le informazioni e di comportamenti sociali (acquisizione, interpretazione, memorizzazione e recupero, ndr), tanto che il 20-30% rientra nella diagnosi clinica di Disordine dello spettro autistico. Le difficoltà sociali sono in particolare legate a difficoltà di riconoscimento delle espressioni facciali (soprattutto paura) che è legata specificamente alla funzione dell’amigdala. Quindi un buon modello mendeliano per studiare i disturbi dell’apprendimento sociale e la fisiopatologia dell’autismo. Il topo con delezione in eterozigosi del gene NF1 ha un deficit selettivo dell’apprendimento sociale accompagnato da un’iperattivazione del pathway MAPK (mitogen-activated protein kinase) nei neuroni dell’amigdala e della corteccia frontale, strutture importanti per i comportamenti sociali. Nell’amigdala si osserva poi un’anomala della neurotrasmissione glutammatergica e di GABA e una importante riduzione di due proteine associate alla neurotrasmissione (Adam22 e proteina heat shock 70). Tutte queste anomalie dell’amigdala sono normalizzate da un’ulteriore delezione della gene chinasi Pak1 (p21 protein-activated kinase). E il blocco farmacologico di Pak1 (regolatore positivo dell’attivazione MAPK) con microiniezione dell’amigdala di un suo inibitore normalizza il comportamento sociale del topo con delezione Nf1.

Informazioni utili per la comprensione dei meccanismi associati alle difficoltà sociali dei soggetti con NF1 e della fisiopatologia autistica. Da notare che in letteratura risulta che nel modello di topo della sindrome Fragile X (Fmr1^-/-) una singola iniezione di inibitore di Pak1 ne annulla le anomalie comportamentali (iperattività e movimenti ripetitivi)(Rescue of fragile X syndrome phenotypes in Fmr1 KO mice by the small-molecule PAK inhibitor FRAX486.PNAS 2013;110:5671)(selezione articoli Aprile 2013).

Quindi un potenziale nuovo approccio terapeutico per la NF1 e per alcune forme di autismo.

Understanding the role of progranulin in Alzheimer’s disease. Nature Medicine 2014;20:109. Commento dell’articolo (Progranulin protects against amyloid β deposition and toxicity in Alzheimer’s disease mouse models. Pg. 1157) in cui si dimostra che nel modello murino di Alzheimer la Progranulina, una proteina secreta che è espressa nella microglia e nei neuroni e che ha una funzione di controllo dei processi neurotrofici ed infiammatori, può contribuire a ridurre le placche amiloidi tipicamente accumulate nel SNC degli affetti da questa malattia neurodegenerativa. In un’altra malattia neurodegenerativa, la Degenerazione lobare fronto-temporale (FTLD), l’aploinsuffineza da mutazione del gene Granulina (MIM #607485) causa la neurodegenerazione e ci sono buone evidenze che la sua sovraespressione possa essere un’efficace terapia per la FTLD. Questo potrebbe valere anche per l’Alzheimer.

A monkey model of Alzheimer’s. Nature 2014;514:276. Breve commento di un articolo (Alzheimer’s Disease-Like Pathology Induced by Amyloid-Oligomers in Nonhuman Primates. Journal of Neuroscience 2014;34:13629) che ricorrendo a un modello animale più appropriato rispetto a quello usuale (topo) è possibile riprodurre molte delle caratteristiche neuropatologiche tipiche dell’Alzheimer nella scimmia. Gli AA hanno iniettato nel SNC dei ratti e dei macachi adulti piccoli aggregati di β-amiloide queste si diffondono nelle aree della memoria e delle funzioni cognitive producendo le lesioni dell’Alzheimer, tra cui la perdita delle connessioni neuronali.

Dendritic spinopathy in transgenic mice expressing ALS/dementia-linked mutant UBQLN2. PNAS 2014;111:14524. Nella ALS/Demenza Fronto-temporale vi è accumulo in grossi aggregati citosolici dei motoneuroni delle proteine mutate, come SOD1, TARDB, FUS, optineurina (OPTN) e Ubiquilina 2 (UBQLN2). Si dimostra che il topo transgenico (microiniezione del transgene in cellula uovo fertilizzata) con la mutazione P497H di UBQLN2, riscontrata nell’uomo in una famiglia con più affetti, comporta una patologia molto simile a quella dell’uomo e consistente in una spinopatia dendritica con accumulo di aggregati proteici, che sono prodotti proteasomici, nelle spine dendritiche, riduzione della densità delle spine e disfunzione sinaptica, soprattutto nell’ippocampo. Quindi nel topo transgenico si osserva un alterato pathway della degradazione proteica, aggregati proteici, una disfunzione sinaptica e deficit cognitivo.

Un primo passo per ulteriori studi sulla demenza con possibili sbocchi terapeutici.

Vedi anche Molecular chaperone Hsp110 rescues a vesicle transport defect produced by an ALS-associated mutant SOD1 protein in squid axoplasm. PNAS 2013;110:5428 sullo studio in un altro topo transgenico per mutazione SOD1 e con possibili risvolti terapeutici (selezione articoli Aprile 2013).

Delivery of an enzyme-IGFII fusion protein to the mouse brain is therapeutic for mucopolysaccharidosis type IIIB. PNAS 2014;111:14870. La m. Sanfilippo tipo B (MPS IIIB)(MIM #252920) è dovuta a mutazioni di un enzima lisosomiale NAGLU (α-N-acetilglucosaminidasi) che causa accumulo di eparan solfato e demenza, disabilità e precoce mortalità (20 anni). Non c’è terapia né enzimatica perché non passa la barriera emato-encefalica né di trapianto allogenico di midollo osseo anche se precoce, che non agiscono sulla patologia neurologica. Ricorrendo ad un modello murino di MPSIIIB per aggirare la barriera è stata iniettata una proteina di fusione NAGLU–IGFII direttamente in un ventricolo cerebrale. Tale enzima modificato entra nei neuroni per endocitosi dove riduce l’accumulo di eparan solfato e di altre sostanze a livelli normali e si diffonde anche al fegato dove produce gli stessi effetti.

Possibile terapia per pz con MPSIIIB (ricordo, da pediatra, che nell’idrocefalia si ricorre da molti anni anche nei neonati al posizionamento di un catetere con valvola esterna in un ventricolo cerebrale, ndr).

Liver-directed gene therapy corrects cardiovascular lesions in feline mucopolysaccharidosis type I. PNAS 2014;111:14894). La m. MPS I è dovuta a mutazioni dell’enzima (IDUA (α-l-iduronidasi): mutazioni di questo gene sono responsabili della m. Hurler (MPS IH)(MIM #607014), m. Scheie (MPS IS)(MIM #607016) e m. Hurler-Scheie (MPS IH/S)(MIM #607015), con MPS IH e MPS IS agli estremi fenotipici (più grave MPS IH) mentre MPS IH ha un fenotipo intermedio. La terapia consiste nel trapianto di midollo osseo (HSCT), che è associato ad una certa morbilità e mortalità, o all’infusione dell’enzima carente che comporta una riduzione della qualità di vita e costi economici elevati. E’ stato sperimentata una nuova terapia che consiste in una terapia genica con vettore virale diretta al fegato (AAV con espressione di IDUA felino da uno promotore fegato-specifico) in un modello naturale felino di MPS I, che ha un fenotipo molto simile a quello dell’uomo, incluso il coinvolgimento progressivo delle valvole cardiache dovuto a una delezione di 3 pb in-frame che causa la perdita di un residuo di aspartato dalla proteina codificata responsabile della completa perdita della sua attività catalitica. Trattati 4 gatti di 3-5 mesi di vita con una iniezione endovena di AAV, tre di questi hanno mostrato un’alta e persistente espressione di IDUA a livello circolante con eliminazione di glicosaminoglicani da tutti i tessuti esaminati e con scomparsa delle lesioni valvolari aortiche già presenti, indicando che con questa terapia è anche possibile raggiungere sedi anatomiche non facilmente raggiungibili con le usuali terapie. Questa terapia è stata applicata con successo in una sperimentazione clinica per un’altra malattia genetica l’l’Emofilia B con effetto a lungo termine senza produzione anticorpale. IMP: potrebbe essere utile anche per altre malattie lisosomiali.

The hereditary spastic paraplegia-related enzyme DDHD2 is a principal brain triglyceride lipase. PNAS 2014;111:14924. Le paraplegie spastiche (SPG) ereditarie sono un gruppo molto numeroso di malattie caratterizzate da una spasticità degli arti inferiori progressiva e grave a trasmissione in gran parte dei casi AD, meno frequentemente XL o AR. Mutazioni di una serina idrolasi, DDHD2, di cui non si conoscono bene i meccanismi di azione, sono causa della SPG54 (MIM #615033).

Nel topo DDHD2 ^-/- so osserva un aumento nel tempo di triacilgliceroli (esteri neutri del glicerolo) nel SNC (analogamente la RM spettroscopica nell’uomo rileva nei pz un accumulo lipidico cerebrale) l’accumulo nel SNC, ma non nel SNP, di gocce lipidiche intracellari dei neuroni accompagnate da deficit motori e cognitivi. Topi normali trattati con un inibitore di DDHD hanno un aumento significativo di triacilgliceroli nel SNC. Tutto questo fa ritenere che questo enzima, che quando carente causa la SPG54, sia la principale idrolasi dei triacilgliceroli a livello del SNC e che la sregolazione di questo pathway sia il principale meccanismo patogenetico di questa condizione.

MALATTIE COMPLESSE/STUDI ASSOCIAZIONE

Common variants near ABCA1 and in PMM2 are associated with primary open-angle glaucoma. Nature Genetics 2014;46:1115.

Common variants near ABCA1, AFAP1 and GMDS confer risk of primary open-angle glaucoma. Nature Genetics 2014;46:1120.

Genome-wide analysis of multi-ancestry cohorts identifies new loci influencing intraocular pressure and susceptibility to glaucoma. Nature Genetics 2014;46:1126.

Studi di associazione genome-wide (GWAS) nel glaucoma primario ad angolo aperto: popolazione cinese il primo, australiana e nordamericana il secondo, multietnico il terzo con ampia sovrapposizione di risultati, ma anche con qualche differenza.