venerdì 16 marzo 2012

Articoli Genetica Clinica/Umana Feb 2012, R. Tenconi


Scelta di articoli di Genetica Clinica nel Febbraio 2012 pubblicati nelle seguenti riviste: Lancet, Lancet Neurology, Nature, Nature Biotechnology, Nature Medicine, Nature Reviews Genetics, Nature Reviews Neurosciences, NEJM, PNAS, Science.

COMPORTAMENTO
Born to be wild? Lancet 2012;379:395. L’argomento riguarda la componente genetica e ambientale dei comportamenti antisociali come l’autoaggressività, l’uso di droghe e disturbi mentali che possono manifestarsi in età adulta con comportamenti criminali. La stima dell’ereditabilità (56-70%) dei comportamenti antisociali ripropone la vecchia domanda se chi delinque è un malato geneticamente determinato, e quindi non condannabile, o invece una persona che lo fa per scelta. Il commento, che cita vari lavori, porta a una conclusione intermedia, con una multifattorialità senza che ci sia uno specifico e identificabile fattore genetico della delinquenza (ricordate la vecchia panzana del cromosoma Y soprannumerario causa di psicopatia criminale?)(Lancet 1968;292:576). Non è mai stato chiarito l’effetto della povertà, uso di droghe (in epoca prenatale e postnatale) e maltrattamento infantile come fattori di rischio di questi disturbi.

Dysregulated microRNA contributes to schizophrenia neuropathology. PNAS 2012;109:2685. Commento di un articolo (MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain functionPNAS 2012;109:3125). Nella schizophrenia vi sono alcuni difetti neuromorfologici come ridotto volume prefrontale e ippocampale, ridotte dimensioni neuronali neocorticali dell’ippocampo e densità dendritica. Sono stati individuati molti geni candidati ma non sono per nulla chiari i meccanismi regolatori ala base di questa patologia. Lo studio riguarda i profili di espressione di 854 piccole sequenze non codificanti (miRNAs) nella corteccia prefrontale di 100 tra controlli (n. 34), persone con disturbo bipolare (n. 31) o schizofrenia (n. 35). E’ stata rilevata una ridotta regolazione di un solo miRNA (miR-132) nel tessuto corticale nel gruppo degli schizophrenici (e in un ulteriore campione con questa stessa patologia comportamentale) e che 26 geni corrispondenti sono sovraregolati nell’intero campione delle persone con schizofrenia. Nel topo l’espressione di miR-132 correla significativamente con lo sviluppo postnatale nella corteccia prefrontale. Tutto questo fa pensare a la sregolazione di questo micro RNA, che regola molti geni e pathway biologici, possa spiegare le varie alterazioni neurologiche e comportamentali della schizofrenia.

Between bedside and bench. Puzzling over schizophrenia
Schizophrenia as a pathway disease. Nat Medicine 2012;18:210. Alla domanda di come e perché un giovane adulto possa manifestare improvvisamente segni e sintomi “bizzarri” dopo decenni di vita normale non c’è ancora una risposta se non l’impressione di una classica malattia da fattori genetici multipli e di fattori ambientali, peraltro non definiti. La terapia attuale della Schizofrenia è per questo del tutto insoddisfacente. E questo nonostante la sua prevalenza (0.3-0.7%  della popolazione generale nel corso di tutta la vita) e la sua gravità clinica (l’attesa di vita è ridotta di 12-15 anni). Il primo articolo propone un interessante modello di come varianti genetiche, parte di un pathway, possono determinare il rischio di malattia. Il secondo articolo (Schizophrenia, social environment and the brain. Pg 211), ancor più interessante per il medico e per la società, riguarda i fattori ambientali che a loro volta agiscono a livello delle regioni cerebrali che fanno parte di un network che controlla il processo sociale-emozionale. L’azione combinata di più fattori genetici e ambientali può influenzare lo stesso circuito neuronale. Tra i vari fattori ambientali, ce ne sono di aspecifici per diverse patologie comportamentali, e di specifici come l’urbanizzazione (rischio x2, c’è un rapporto dose/rischio) e migrazione (rischio x2). Non si sa quali ne siano i meccanismi patogenetici, che potrebbero essere, come sottolineato dai sociologi e dagli psicologi nel passato, da frammentazione sociale, marginalizzazione sociale e deprivazione che potrebbe agire sull’asse ipotalamo-ipofisi-surrene e sulla stimolazione del sistema mesolimbico dopaminergico. Studi di RM cerebrale funzionale che individuano aspetti tipi di schizofrenia addirittura prima della comparsa dei segni clinici possono fornire un notevole contributo alle conoscenze.
Il genoma non può agevolmente essere influenzato, come lo sono invece i fattori ambientali.
La prevenzione, come sempre e soprattutto per le malattie multifattoriali, si fa con successo agendo sui fattori ambientali. La terapia farmacologica la si fa comprendendo i meccanismi biologici predisponenti.

NUOVI GENI PER VECCHIE MALATTIE
Truncations of Titin Causing Dilated Cardiomyopathy. NEJM 2012;366:619. Nel 40-70% dei pz con cardiomiopatia ipertrofica si identifica la mutazione causativa in uno degli 8 geni-malattia noti; nel 20-30% dei pz con m. dilatativa, familiare nel 30-50% dei casi, si trova la mutazione di uno dei 40 geni-malattia. Quando un gene è molto grande (100 kb di sequenza codificante del TTN) si tende a escluderlo dall’analisi di routine e si aspetta NGS. Mutazioni del gene Titanina (Connettina)(OMIM *188840) sono responsabili di 6-7 malattie muscolari o miocardiopatie dilatative (soprattutto) o ipertrofiche. Lo studio con NGS ha individuato una mutazione TTN causativa in 54 dei 312 pz (27%) con m. dilatativa e in 3 dei 231 pz (1%) con m. ipertrofica. Le mutazioni sono troncanti. TTN deve essere incluso tra i geni da testare soprattutto nelle m. dilatative, usando le tecniche appropriate.

Inactivating KISS1 Mutation and Hypogonadotropic Hypogonadism. NEJM 2012;366:629.
Usando l’analisi di autozigosità e poi l’analisi esomica è stato individuate un gene (KISS1) responsabile di ipogonadismo ipogonadotropo normosomico in una figlia di una coppia di consanguinei. Il gene è quindi fondamentale per l’inizio dello sviluppo puberale.

MALATTIE GENETICHE
Hereditary angio-oedema. Lancet 2012;379:474. Seminario su una patologia frequentemente letale per improvviso edema laringeo da mutazione in eterozigosi di un C1-inibitore che regola vari pathway infiammatori (OMIM #106100). La carenza di C1-inibitore provoca il rilascio di sostanze che aumentano la permeabilità dei capillari causando in certe circostanze edemi cutanei e delle mucose, nel 50% dei casi edema laringeo. Aggiornamento sulla clinica, sulla diagnosi e sulle più recenti terapie per ridurre l’edema acuto.

Compound inheritance of a low-frequency regulatory SNP and a rare null mutation in exon-junction complex subunit RBM8A causes TAR syndrome. Nat Genetics advance online publication 2012.
La s. TAR (s. Trombocitopenia e assenza di radio, OMIM #274000), malattia AR in cui nel 2007 è stato identificata negli affetti una delezione di 200 kb contenente 11 geni a livello di 1q21.1; mancava la seconda mutazione. Il lavoro pubblicato, i cui risultati erano stati appena accennati nel meeting 2012 della ESHG, completa il quadro concludendo che la TAR è una malattia composta da meccanismo ipomorfico con un allele raro nullo e l’altro con ridotta espressione.

MALATTIE NEUROLOGICHE
Temporal and developmental requirements for the Prader–Willi imprinting center. PNAS 2012;109:3446. S. Prader–Willi (PWS) e la s. Angelman (AS) sono malattie genetiche da ridotta espressione di un cluster di geni imprinting a livello 15q11-q13. In questa sede vi sono due centri imprinting (AS-IC e PWS-IC) che cooperano in tale processo. Nel modello murino la delezione di PWS-IC nell’embrione prima dell’impianto abolisce l’espressione dei soli geni paterni nell’encefalo neonatale, mentre la stessa delezione nelle cellule progenitrici non condiziona l’imprinting dei geni PWS/AS nell’encefalo neonatale.
Questo significa che il centro imprinting PWS è necessario in epoca postzigotica per l’espressione dei geni paterni, ma poi non serve più per il mantenimento dell’epigenotipo paterno.

Damage that precedes Parkinson symptoms. PNAS 2012;109:3191. Commento dell’articolo Impaired neurotransmission caused by overexpression of α-synuclein in nigral dopamine neurons. PNAS io2012;109:3213. Il Parkinson è caratterizzato da perdita del controllo motorio da morte progressive delle cellule della sostanza nigra che producono dopamina, a partenza assonale per poi interessare il corpo cellulare. Nel topo è stato verificato se la sovraespressione di alfa-sinucleina, proteina che regola l’accumulo e il rilascio dopaminico, degrada la funzione sinaptica prima dell’inizio dei segni del Parkinson. Nel corpo striato dopo 10 giorni di trattamento e precedendo il danno assonale il riassorbimento (reuptake) dopaminico è ridotto del 50% con successiva riduzione del suo rilascio e segni degenertivi terminali assonali che precedono la morte cellulare. Questo conferma che alterazioni di segnale dopaminico sono i primi segni del parkinsonismo.

Mutation in C9orf72 changes the boundaries of ALS and FTD. Lancet Neurol 2012;11:205. Commento di un articolo sulla Sclerosi Laterale Amiotrofica (ASL) con Demenza Fronto-Temporale (FTD) dovuta a un’espansione di sequenze ripetute di 6 nucleotidi (GGGGCC) in una regione non codificante del gene C9orf72 (Lancet Neurol 2012;11:232)(vedi anche lettera su NEJM 2012;366:283 citata nella selezione degli articoli di interesse 1/2012). L’articolo illustra gli aspetti clinici della ALS da mutazione C9orf72 utilizzando i dati raccolti prospetticamente in registro di 435 pz ALS, in cui nel 41% dei casi familiari (n° 49) e nel 5% dei casi sporadici (n° 386) sono presenti > di 30 espansioni (non espansione nei 188 controlli). La mutazione comporta un’età di comparsa dei segni più precoce, una minor sopravvivenza, maggior frequenza di deficit cognitivo e di lesioni corticali alla RM e una familiarità per altre malattie neurodegenerative come la DFT.
Da sottolineare che la mutazione di altri geni della ALS (SOD1, TARDBP, OPTN, UBQLN2, or FUS) può determinare, anche se molto più raramente, deficit cognitivo. Vi sono altri due aspetti significativi del lavoro: 1) un algoritmo che nel caso di ASL o FTD consente di specificare la probabilità di mutazione del gene C9orf72; 2) ancor più importante, per la ridotta penetranza di mutazione dei vari geni ASL, è per ora improponibile l’uso del test genetico predittivo (vedi linee guida Eur J Neurol 2012;19:360).
Queste cautele saranno mantenute dai Laboratori diagnostici?

CEP41 is mutated in Joubert syndrome and is required for tubulin glutamylation at the cilium. Nat Gednetics 2012;44:193. Lavoro collaborativo, tra cui F. Brancati e EM Valente, che ha identificato un altro gene (CEP41) di una sindrome con estrema eterogeneità di locus, la s. Joubert (JBTS15), che codifica una proteina centrosomica.

Evolutionarily Assembled cis-Regulatory Module at a Human Ciliopathy Locus. Science 2012;335:966.
Lavoro collaborativo, tra cui ricercatori che si occupano da anni di ciliopatie, in cui si dimostra che nell’evoluzione nei vertebrati i geni coinvolti nella ciliogenesi sono organizzati in cluster funzionale che condividono elementi regolatori. Mutazione di uno di due geni (TMEM138 or TMEM216), che non hanno alcuna omologia di sequenza ma sono posizionati testa-coda, causano un unico fenotipo indistinguibile, s. Joubert. L’espressione di questi due geni è mediata da un elemento regolatorio conservato localizzato nella regione intergenica non codificante.

The Autosomal Recessive Cerebellar Ataxias. Review article. NEJM 2012;366:636. Atassia: mancanza di coordinazione dei movimenti e di equilibrio da disfunzione cerebellare. Se acuta, con l’eccezione di sintomi da m. metaboliche, non è su base neurodegenerativa. Le forme monogeniche sono AD, con comparsa intorno a 35 anni, XL (fragile X e adrenomieloneuropatia) e AR a comparsa prima dei 3a anni con progressivo peggioramento dell’andatura e dell’equilibrio o con ipotonia muscolare e difficoltà di coordinazione dei movimenti. Per la molteplicità dei segni spesso il pz giunge all’osservazione genetica dopo essere stato valutato, anche a lungo, dall’internista o dal neurologo per neuropatia (assenza di riflessi OT)(esperienza personale: pz di 38 anni con Atassia Friedreich inviato per assonopatia da meglio definire in previsione di una gravidanza), anomalie oculo-motorie, ipereflessia e spasticità, deficit intellettivo, epilessia. La review elenca le varie forme, i fenotipi più comuni, propone un algoritmo diagnostico e le terapie per alcune forme.

Mitochondrial dysfunction and Purkinje cell loss in autosomal recessive(spastic ataxia of Charlevoix-Saguenay (ARSACS). Pnas 2012;109:1661. Modello animale di una atassia AR (OMIM 270550) a inizio infantile, rara, da mutazione di un gene (SACS) che codifica una proteina (sacsina), a funzione non nota. Nel topo knockout viene dimostrata una degenerazione età-dipendente delle cellule Purkinje cerebellari. La sacsina si localizza nei mitocondri dei neuroni primari e interagisce con la proteina dinamina 1 partecipando alla fissione dei mitocondri.Nei fibroblasti del paziente è stata confermato il difetto di fissione dei mitocondri che è quindi la base cellulare della ARSACS

MODELLI ANIMALI
SIRT 1 and anxiety. Nat Genetics 2012;44:120. Il controllo dell’ansia, un’emozione che si produce in condizioni di minaccia o di sfida, è indispensabile per la sopravvivenza quando ci si confronta con i propri simili o si esplorano nuovi ambienti. Il difficile controllo dell’ansia è una frequente patologia nell’uomo (26% delle persone >18 anni in USA). La terapia dei disturbi d’ansia e della depressione consiste nell’uso di farmaci che inibiscono le monoamino ossidasi e la ricaptazione serotonino-specifica. Viene commentato un lavoro (Cell 2011;147:1459) in cui si prova nel topo che il gene Sirt1 aumenta la trascrizione del gene Maoa che codifica la monoaminossidasi A (quest’ultimo gene nell’uomo è associato a comportamento asociale e, mutato, alla sindrome Brunner OMIM #300615) riducendo i livelli serotoninico nell’encefalo. Il topo knockout del gene Sirt1 a livello cerebrale ha migliori prestazioni comportamentali esplorative e una maggior resistenza alla depressione (esposizione frequenti e ripetute a maschi più dominanti) rispetto ai controlli, contrariamente ai topi con sovraespressione di Maoa che hanno una limitazione dell’esplorazione ambientale.
Ma per altri aspetti SIRT1 svolge un’azione protettiva.

Preventing ‘SIRTain’ death by mutant huntingtin. Nat Rev Neuroscience 201;13. Commenti di due lavori che sottolineano il ruolo preventivo svolto dell’enzima codificato da SIRT 1 nel modello animale (topo) di Corea Huntington: il primo sulla sovraespressione di Sirt1 che comporta ritardo di inizio e della progressione del deficit motorio e riduce l’atrofia dello striato mentre il knockout a livello cerebrale Sirt1 ha un’esarcebazione dei sintomi (Neuroprotective role of Sirt1 in mammalian models of Huntington’s disease through activation of multiple Sirt1 targets. Nat Medicine 2012;18:153) e il secondo in cui si mostra la protezione dalla degenerazione dello striato in un altro modello animale (Sirt1 mediates neuroprotection from mutant huntingtin by activation of the TORC1 and CREB transcriptional pathway. Nat Medicine 2012;18:159). I lavori suggeriscono che la riduzione dell’attività di SIRT1 mediata dalla mutazione CH potrebbe essere il meccanismo neuropatologico della malattia. Quindi un’indicazione per una terapia mirata su SIRT1 nella CH.

Crh and Oprm1 mediate anxiety-related behavior and social approach in a mouse model of MECP2 duplication syndrome. Nat Genet 2012;44;206. La sindrome da duplicazione (triplicazione) della regione genomica che contiene i geni MECP2 (mutazione con perdita di funzione del gene causano la s. Rett) e IRAK1 è ben nota e comporta oltre a importanti problemi neurologici anche disturbi comportamentale come autismo e ansietà. Gli stessi disturbi comportamentali si osservano nei topi con sovraespressione (x 2 o x3) di MECP2. Viene dimostrato che nel topo MECP2 controlla pathway che condizionano l’ansia e i comportamenti sociali. L’individuazione di questi geni  potrà favorire una specifica terapia di queste patologie comportamentali non solo nella s. Rett ma probabilmente anche quando sono isolati e non parte di una condizione sindromica.

MeCP2: only 100% will do. Nat Neuroscience News & Views 2012;15:176. A knock-in mouse mimicking a MeCP2 mutation found in human Rett syndrome recapitulates disease features, including progressive motor and cognitive impairments—and correlations emerge between MeCP2 dosage in mice and phenotype. Nei modelli animali sia la sovra- che la ridotta espressione della proteina sono responsabili di segni clinici simili a quelli della s. Rett nell’uomo; non è chiaro se mutazioni diverse possano causare fenotipi diversi. Il commento citato è relativo a un articolo sulla stessa rivista (Rett syndrome mutation MeCP2 T158A disrupts DNA binding, protein stability and ERP responses. pg 274) dell’effetto fenotipico e delle variazioni di funzione del gene Mecp2 da mutazione localizzata nella sede più comunemente interessata da mutazioni nell’uomo che riduce sia la funzione che i livelli di proteina. Il fenotipo nel topo è simile a quello della s. Rett. Pur essendo i livelli di proteina simili a quelli di topi con altra mutazione il quadro clinico è più grave e questo è dovuto a una sua funzione legante maggiormente compromessa. Dai risultati risulta che la gravità del fenotipo è età dipendente e inversamente correlata con la residua funzione dei MeCP2 e che più bassi livelli di proteina MeCP2 comportano minor patologia comportamentale. Quindi la variabilità clinica nella s. Rett è probabilmente mutazione specifica. I difetti neurologici sono età dipendente anche nel topo probabilmente per una mancato mantenimento della funzione neuronale. Una buona indicazione per le possibili terapie nella s. Rett è costituita dalla osservazione che nel topo la normalizzazione di espressione di MeCP2 postnatale è in gravo di rallentare o annullare il fenotipo neurologico, quindi l’alterazione del network neuronale è reversibile.

Gene expression trends shed light on congenital defects. PNAS 2012;109:2685. Commento dell’articolo "Congenital diaphragmatic hernia candidate genes derived from embryonic transcriptomes. PNAS 2012;109: 2978". Spettro malformativo frequente (1:3000 nati vivi) a sopravvivenza limitata in parte anche per l’eterogeneità delle cause (sindromica nel 40% dei casi). L’identificazione dei geni responsabili è stata sinora fatta con l’approccio genetico standard. Gli AA hanno usato un altro approccio studiando nel topo i profili di espressione, non di singoli geni ma dell’intero trascrittoma, nel tessuto diaframmatico nelle varie fasi dello sviluppo embrionale, per identificare geni che sono temporalmente coespressi e parte di pathway simili.
Il confronto poi con geni già noti nel determinare, quando mutati, difetti diaframmatici (CDH) nell’uomo e nei modellli murini ha consentito di individuare 27 candidati per questa malformazione.
Questi 27 geni non mappano negli hotspot CDH nell’uomo (delezioni o duplicazioni ricorrenti legate ala malformazione). Per validare tale strategia è stato studiato lo sviluppo del diaframma nel topo knockout di uno di questi geni (Pbx1) e sono state rilevati difetti di muscolarizazione e tissutali diaframmatici. Questa potrebbe essere una strategia da adottare per altre condizioni malformative geneticamente eterogenee.

Trisomy of the G protein-coupled K+ channel gene, Kcnj6, affects reward mechanisms, cognitive functions, and synaptic plasticity in mice. PNAS 2012;109:2642. La subunità della proteina GIRK (G protein-activated inwardly rectifying K+ channels) è abbondante nell’encefalo e svolge varie funzioni, come l’apprendimento, la memoria, alcuni aspetti comportamentali, la coordinazione motoria e patologie come la s. Down. Il gene è localizzato sul cromosoma 21 (q22.13). Topi trisomici per il gene (Kcnj6) hanno un deficit di memoria e di apprendimento ippocampo-dipendente e accentuata depressione di lungo termine.
Lo studio di modelli animali con trisomia di alcuni di questi geni potrebbe contribuire alla comprensione del complesso fenotipo che caratterizza tale frequente malattia genetica.

NGS
Genetic insights into the causes and classifi cation of cerebral palsies”. Lancet Neurol 2012;11:283 (erratum pg 208). Aveva ragione Freud nel sospettare che la Paralisi Cerebrale (prevalenza attuale 3.3/1000 all’età di 8 anni) non fosse una patologia perinatale ma d’origine prenatale da danno dello sviluppo encefalico fetale. Ma la tradizione medica, scientifica e legale ha insistito stoltamente a definirla come dovuta un evento perinatale. Ma la NGS potrebbe venire in soccorso dei poveri colleghi ostetrici (NB gli autori della review sono Genetisti). Viene riportata la classificazione delle PC e i criteri clinici che indicano un’asfissia intrapartum. Ma molti elementi fanno pensare a una base genetica per molti casi di PC (familiarità, consanguineità, MZ vs DZ, età dei genitori, malformazioni presenti nell’11-32% dei casi). Ma è solo nel 2004 che viene pubblicato il primo gene della PC; ora sono identificati almeno 6 geni-malattia della PC, degli attesi centinaia. Gli studi di associazione non hanno contribuito a identificare nuovi geni, mentre l’analisi arra-CNV ha individuato in una famiglia di consanguinei una delezione in omozigosi di uno degli adaptor protein complex (uno dei geni noti della PC).
E NGS? Promettente. Avremo, penso, presto i risultati. Nel frattempo per i pediatri e per i genetisti: in consulenza non colpevolizziamo i colleghi ostetrici e conserviamo DNA della famiglia per il prossimissimo futuro (per alcuni è già il presente).

Sequencing diagnoses disease. Nature 2012;482:9. Commento di un articolo (Molecular Diagnosis of Infantile Mitochondrial Disease with Targeted Next-Generation Sequencing Sci Transl Med 2012:4:118ra10)(che non ho on-line) che mostra sia le promesse che le limitazioni del NGS per la diagnosi di malattie genetiche. L’analisi di sequenza del mtDNA e della regioni codificanti di > 1000 geni nucleari che codificano le proteine dei mitocondri ha identificato in 23 bambini /42 con sintomi di malattia mitocondriale una mutazione di un gene noto o di un possibile gene-malattia; in 10 di questi bambini la diagnosi molecolare è certa. Gli AA concludono che nei casi senza diagnosi alla NGS la mutazione è probabilmente localizzata fuori dalle regioni sequenziate (incluso quelli casi con diagnosi di prima approssimazione sbagliata, ndr) o vi è un’interazione tra vari geni mutati.

The changes that count. Nature 2012;482:257. As more mutations are found across the genome, geneticists are focusing on learning which ones are likely to cause human disease, and how.
Per ogni persona >3 milioni di varianti nell’intero genoma, 20,000 solo per tratti codificanti (1.5% del genoma) e non sinonimi. Ci sono algoritmi (es.SIFT http://sift.bii.a-star.edu.sg/ oppure PolyPhen-2 http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) che predicono se una variante altera la funzione della proteina, o la sua espressione, se è tollerata dall’evoluzione e se è presente nelle persone sane (The evolution has tested it and that’s why you don’t see that mutation). Ma il risultato non ne assicura ancora la patogenicità. Anche se l’algoritmo fosse perfetto basandosi sulla sequenza proteica perderemmo le varianti di tratti che non codificano proteine (e l’analisi dell’evoluzione ci dice che la selezione naturale ha conservato di più -5 volte tanto- questi tratti rispetto a quelli codificanti, e quindi devono avere un effetto biologico). Quindi altri vi sono altri algoritmi (GERP http://mendel.stanford.edu/SidowLab/downloads/gerp oppure phastCons http://compgen.bscb.cornell.edu/phast). Uno poi non si chiede se un tratto sia conservato nell’evoluzione ma se e quando è stato descritto nell’uomo classificando le varianti trovate (VAAST (www.yandell-lab.org/software/vaast.html), algoritmo che ha consentito di classificare la mutazione della s. Ogden)(vedi blog). Un altro è ANNOVAR (http://www.openbioinformatics.org/annovar). Il passo successivo è quello di fare una lista di varianti per ordine di priorità.
Per regioni con funzione nota si può verificare l’effetto fenotipico di centinaia di varianti ricorrendo a
batteri o a funghi in un solo esperimento.
Ancora molto da fare ma “The marriage of human genetics and functional genomics can deliver what the original plan of the human genome promised to medicine.” Molto bello.

Genomic Medicine. Genomics, Intellectual Disability, and Autism. NEJM 2012;366:733. Review su patologie frequenti (DI 1.5-2% e Autismo 0.7-1% della popolazione) spesso senza causa identificata. Le nuove tecniche (array-CGH, SNP genotyping arrays e NGS) ci aiutano a far diagnosi. Potere diagnostico: Array-CGH: nel 12-14% dei casi (credo escluse le comuni anomalie cromosomiche)(l’algoritmo diagnostico è preso e semplificato rispetto a quello AJHG 2010;86:749); vi è indicazione per questo test anche per epilessia, ADHD e epilessia. In alcune condizioni il quadro clinico delle CNV è noto (es. del17q21.31), per altre (del o dup) è variabile (es. 16p11.2). Per le monogeniche sono circa 100 i geni XL responsabili del 10% dei casi. La tecnica NGS, in particolare l’analisi dei soli esoni (a 750 euro) ,è quella più facilmente applicabile e che ha reso possibile l’identificazione del gene in alcune malattie. L’approccio diagnostico varia: analisi di più affetti da una condizione apparentemente omogenea (nella s. Freeman–Sheldon ne sono bastati 4); l’assenza nei genitori di variazione osservata nel paziente (in media si ritiene che ogni neonato abbia una sola variazione che modifica la sequenza proteica) in un gene plausibile per la malattia (cita un lavoro su deficit intellettivo su Nat Genet -2010;42:1109 - le cui conclusioni però sono state molto discusse- effetto Brunner, ndr); l’analisi di mutazioni in omozigosi nei figli di consanguinei, con localizzazione favorita da una precedente analisi di linkage o altro. Nella diagnostica clinica alcuni laboratori si sono organizzati nell’offrire NGS per un numero limitato di geni (es. analisi di 30 o 60 o 90 geni XLMR) fornendo non solo i dati ma anche la loro interpretazione. Note di cautela: ognuno di noi è portatore di circa 5000 variazioni che interessano sequenze  proteiche potenzialmente deleterie e 100-200 varianti in eterozigosi private che hanno potenzialmente un effetto clinico. Che necessitano di confronti e di follow-up. Nulla di nuovo ma utile per una visione generale.

Il commento a questa review (Realizing Genomic Medicine. Editorial NEJM 2012;366:757) sottolinea che alla fine del 2012 NIH finanzierà un’analisi esomica o dell’intero genoma di circa 70000 persone con fenotipo ben caratterizzato. Ci sono ancora alcuni aspetti da definire relativi all’esatta delimitazione di quanto è ricerca e di quanto è clinica (un aspetto citato dall’editoriale riguarda l’argomento presentato nel blog “discutiamone” sulla s. Ogden), alle risorse e le conoscenze necessarie per interpretare i dati, alla costituzione di un’equipe multidisciplinare che possa interpretare i dati e il ruolo dei consulenti genetisti sinora dedicati alle anomalie cromosomiche e alle monogeniche.
Sarebbe comunque non realistico pensare che il sistema sanitario e il progresso clinico possano procedere con le stesse accelerazioni del progresso tecnologico.

Gene Losses in the Human Genome. Science Perspective 2012;335:806. A Systematic Survey of Loss-of-Function Variants in Human Protein-Coding Genes. 2012;335:806
L’interpretazione dei risultati dell’analisi NGS è resa difficile dalla quantità di dati che escono e che vanno filtrati. Uno dei criteri è l’effetto che la variante ha sul prodotto genico, quelle con perdita di funzione (LoF) sono classicamente considerate rare e a alta probabilità di patogenicità (ipotesi “less is less”), anche se alcune FoP potrebbero avere una selezione positiva (ipotesi “less is more”) o essere neutre (ipotesi “less is nothing”). Lo studio analizza la frequenza e l’effetto di queste varianti LoF che risulta da NGS di 2951 possibili LoF, ridotte dopo filtraggio a 1285, di 185 genomi umani (parte del 1000 Genomes Project) di diverse popolazioni. In base al gruppo etnico ogni persona ha 26-37 varianti che introducono un codone di stop, con più di 6 in omozigosi. Considerando altre varianti (che alterano sito splicing, indel, frameshift) ogni persona ne ha 103-121 di cui 20 in omozigosi. Significativamente aumentate LoF negli alleli a bassa frequenza (tenuta tale probabilmente dalla selezione), alcuni associati a malattia (conferma di “less is less”). Altre LoF sono frequenti in geni evoluzionariamente poco conservati o ridondanti (conferma “less is nothing”). Altre ancora (20) sono in sedi che sembrano godere di selezione positiva nell’evoluzione (conferma “less is more”). L’espressione genica in una ridotta proporzione di LoF risulta ridotta.
Conclusione: cautela di attribuzione di patogenicità a variazioni LoF. Vari fattori possono indurre a falsi positivi nella classe di variazione LoF e va posta cautela in questa attribuzione nei progetti clinici di sequenziamento; ancora cautela nell’assegnare effetto clinico a nuove o rare LoF trovate in un pz. I dati di questo lavoro sono/saranno inseriti nella sequenza di riferimento in modo da migliorare i sistemi di filtraggio. Tipicamente il genoma “sano” contiene circa 100 LoF genuine, in gran parte in eterozigosi; se, in base a stime ricavate da studi dei figli di consanguinei, ciascuno di noi è portatore di 2-5 alleli recessivi letali probabilmente buona parte di questeLoF sono varianti non significative anche se alcune potrebbero avere un effetto sulla variazione del fenotipo.

TERAPIA
An eye for gene repair. Nature 2012;482:8. Bel titolo di un articolo (Gene therapy rescues photoreceptor blindness in dogs and paves the way for treating human X-linked retinitis pigmentosa PNAS 2012;109:2132) sulla terapia tramite iniezione subretinica di un adenovirus che porta il gene malattia della retinite pigmentosa da mutazione del gene RPGR nel cane (OMIM #300029). Nell’occhio trattato la struttura dei fotorecettori è diventata normale e la risposta alla luce migliorata in 3 su 4 occhi. Vedi precedenti selezioni di articoli sulla terapia genica nelle retiniti pigmentose.

Drug bests cystic-fibrosis mutation. Nature 2012;482:145. New Cystic Fibrosis Drug Offers Hope, at a Price. Science 335:645. First treatment to tackle protein behind the disease wins approval — but only a small fraction of patients will benefit. Quando il doppio cieco non è più cieco: “We had two brothers in the trial, after two weeks the pair stepped out of the lift together and it was clear who was taking the drug. The younger brother looked sturdier. It reminded me of the change in appearance that we see in patients with cystic fibrosis after they have lung transplants.” (Borowitz, pneumologo pediatra). Approvata (31 Gennaio 2012) dal FDA USA la terapia farmacologica con Ivacaftor (Kalydeco o VX-770) per pazienti con mutazione G551D (4% dei pz FC), il primo farmaco che cura la malattia, non i suoi sintomi (vedi Nature Biotechnology 2011;29:465 citato nella Selezione articoli interesse 3/2011). Il problema: costa US $294,000 all’anno per persona. Ma all’orizzonte ci sono altri farmaci, come VX-809 per mutazione ΔF508, molto più frequente della G551D, e l’Ataluren per mutazioni troncanti, che sono nelle fasi finali della sperimentazione clinica.

Survival in BRAF V600–Mutant Advanced Melanoma Treated with Vemurafenib. NEJM 2012;366:707. A multicenter phase 2 trial of vemurafenib in patients with previously treated BRAF V600–mutant metastatic melanoma. Risposta clinica in più della metà dei pz. (vedi The Beginning of the Beginning. NEJM 2012;365:2325)(selezione articoli di interesse 1/2012).

Amyloid disease drug approved. Nat Biotechnol 2012;30:121. Approvata a livello europeo, anche se con critiche, la terapia farmacologica con Vyndaqel (Tafamidis) della Pfizer per la cura della Amiloidosi da Transtiretina (OMIM #105210) la più frequente amiloidosi ereditaria. La proteina ha funzione di trasporto della tiroxina e della proteina legante il retinolo. Le mutazioni da misfolding proteico causano un deposito extra cellulare di proteine in vari tessuti.

Clinical implications of basic research: gene therapy meets stem cells. NEJM 2012;366:567. “The goal of developing pluripotent cells that can transmute to organ-specific maturity at our direction, and possibly cure many human diseases, has yet to be attained”, anche se “gene correction involving stem cells is closer to being within our grasp”. Cita un lavoro (Targeted gene correction of α1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells. Nature 2011;478:391) in cui il difetto di α1-antitripsina è stato curato ricorrendo a induced pluripotent stem cells (iPSCs) derivate dal paziente, in cui è stato corretta la mutazione, le cellule trasformate in epatociti e reintrodotte nel pz nel giro di 4 mesi (le iPSCs sono derivate da cellule somatiche differenziate e differiscono dalle cellule staminali derivate da un embrione). Non osservato accumulo di mutazioni casuali nelle cellule fatte crescere in vitro (ad es. coinvolgendo oncogeni), nel modello animale (topo). Nel difetto α1-antitripsina la terapia dovrebbe essere applicata molto precocemente per la rapida evoluzione della malattia (cirrosi epatica e patologia polmonare).

Cardiac symptoms of Rett syndrome. Nat Genetics 2012;44:120. Commento di un lavoro (Pathogenesis of lethal cardiac arrhythmias in Mecp2 mutant mice: implication for therapy in Rett syndrome. Sci. Transl. Med. 3, 113ra125, 2011)(non ho accesso al pdf) su una delle frequenti cause di morte improvvisa nella s. Rett da aritmia cardiaca; il 18.5% degli affetti ha intervallo QT lungo. Il topo Mecp2-null  e la femmina portatrice hanno aritmie cardiache e QT lungo. Il fenotipo cardiaco del topo Mecp2-null può essere curato con un farmaco che blocca il canale Na ma non da un antagonista del recettore ß-adrenergico, il che fa pensare a un meccanismo patologico di ritardata chiusura del canale.

Ganglioside GM1 induces phosphorylation of mutant huntingtin and restores normal motor behavior in Huntington disease mice. PNAS 2012;109;3528. In uno studio collaborativo alcuni AA dell’Ist. Auxologico di MI riportano che nel modello murino l’infusione intraventricolare di ganglioside GM1 induce la fosforilazione della proteina mutante e ne attenua la tossicità, migliorando la funzione motoria dell’animale già sintomatico. Possibile terapia per una malattia per ora non curabile.

PNAS 2012;109:3510. Medicinal plant shows promise for Alzheimer’s treatment. PNAS 2012;109: 3191. Commenti di un lavoro (Withania somnifera reverses Alzheimer’s disease pathology by enhancing low-density lipoprotein receptor-related protein in liver. PNAS 2012;109:3510). La terapia dell’Alzheimer mira a ridurre l’accumulo di proteina amiloide a livello cerebrale che causa il deficit cognitivo. Nel modello murino è stato testato un prodotto vegetale (Withania somnifera), usato nella medicina Ayurvedica (antica medicina indiana) per le sue proprietà di potenziamento della memoria.
Negli animali di media età (9-10 mesi) o anziani (2 anni) trattati oralmente per 30 giorni con estratto di radice, che contiene steroidi, è stato dimostrata una significativa riduzione di placche nell’encefalo e riduzione della proteina amiloidea nella corteccia e nell’ippocampo, mentre è stato documentato un incremento di tale proteina nel sangue. Dopo una sola settimana di trattamento è stata rilevato anche un incremento di proteina receptor-like nel sangue e nel fegato. I test cognitivi hanno mostrato migliori prestazioni negli animali trattati.
La caratterizzazione dell’estratto e l’ottimizzazione del trattamento possono portare a una terapia così diffusa e devastante (terapia “della nonna” senza aspettare la chimera delle cellule staminali, ndr).

TERATOLOGIA
Heritable side-effects of chemotherapeutic agents. PNAS 2012;109:2686. Commento di un articolo (Exposure to anticancer drugs can result in transgenerational genomic instability in mice. PNAS 2012;109: 2984) che riguarda lo studio nel topo dell’effetto genotossico da chemioterapia. Dopo 8 settimane dalla somministrazione nel maschio di un'unica dose terapeutica di un chemioterapico (ciclofosfamide o mitomicina C o procarbazina) il topo è stato incrociato con femmina non esposta e è stata verificata la presenza di mutazioni, analizzando una specifica regione del DNA non codificante, nelle cellule spermatiche e nel midollo osseo dei figli maschi non esposti. L’esposizione paterna al farmaco ha comportato un raddoppiamento della frequenza di mutazioni nelle cellule spermatiche e nel MO dei figli degli esposti, non solo nell’allele del padre ma anche in quello della madre (non esposta). Risultato inatteso che potrebbe essere dovuto a una destabilizzazione genomica in più tessuti. Rimane da vedere se lo stesso avviene per tratti codificanti. (questi risultati vanno confrontati con i risultati già disponibili di studi prospettici e retrospettivi nell’uomo, ndr).

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