Selezione Articoli Genetica Clinica/Umana Luglio 2013. R. Tenconi

Scelta di articoli di Genetica Clinica/Umana pubblicati in Luglio 2013 nelle seguenti riviste: Lancet, Lancet Neurology, Nature, Nature Neuroscience, Nature Biotechnology, Nature Genetics, Nature Medicine, Nature Reviews Genetics, Nature Reviews Neuroscience, NEJM, PNAS, Science & Cell.

MALATTIE NEUROLOGICHE/NEURODEGENERATIVE/PSICHIATRICHE

Intrinsic connectivity networks in healthy subjects explain clinical variability in Alzheimer’s disease. PNAS 2013;110:11606. Non si conoscono I fattori che determinano la grande etorogeneità clinico-anatomica della m. Alzheimer. Un meccanismo che potrebbe spiegare lo specifico coinvolgimento di differenti regioni cerebrali nella varianti di AD è quello di una diffusione della malattia (come una malattia su base infettiva da prioni) attraverso differenti network funzionali. Con tecniche di analisi in neuroimmagini sembra che sia così.

Huntington’s disease: the road to progress. Lancet Neurology 2013;12:624. Commento di un articolo sulle stesso fascicolo (Predictors of phenotypic progression and disease onset in premanifest and early-stage Huntington’s disease in the TRACK-HD study: analysis of 36-month observational data. Pg. 637) in cui si identificano strumenti idonei per verificare nel tempo l’evoluzione della malattia in ogni pz, utilizzando strumenti clinici molto semplici e strumenti più complessi. L’editoriale inizia con una considerazione generale della pratica medica, ben condivisibile: “Most clinicians carry, in their heads, roadmaps of the time course of the disorders they frequently treat. Drawn from experience with different patients over time, these composite roadmaps are useful for educating patients, designing possible rating scales, and providing a subjective way to assess treatment results” (da questa frase si desume che il medico si prende cura del singolo pz, segue l’evoluzione della malattia e valuta se il trattamento prescritto ha avuto l’effetto desiderato. Ma esiste ancora un medico cosi? Ndr).

Presymptomatic features of spinocerebellar ataxias. Lancet Neurology 2013;12:625. Commento di un articolo sullo stesso fascicolo (Biological and clinical characteristics of individuals at risk for

spinocerebellar ataxia types 1, 2, 3, and 6 in the longitudinal RISCA study: analysis of baseline data. Pg. 650)(alcuni AA sono italiani) sugli aspetti, clinici e biologici, in epoca presintomatica di alcune atassie spino-cerebellari (SCA). Vi sono più di 30 malattie genetiche di atassia spino-cerebellare progressiva a trasmissione AD, le più frequenti (oltre la metà dei casi) sono SCA1, SCA2, SCA3, or SCA6. Tutte sono caratterizzate da espansione di ripetizioni poliglutaminiche con una relazione inversa tra dimensioni della ripetizione e età di insorgenza. Nello studio longitudinale RISCA sono riportati i risultati ottenuti osservando 123 portatori asintomatici della mutazione e 141 congiunti non portatori. Non è una sorpresa, dice il commento, che l’esame fisico accurato e la morfometria con MRI di 83 partecipanti mostri segni neurologici e differenze morfologiche tra portatori e non portatori. Ma alcuni dati sono interessanti: il numero di ripetizioni di triplette spiega solo il 41-67% della variabilità dell’età di comparsa dei primi segni atassici; viene presentata la distribuzione dei segni neurodegenerativi nelle prime fasi di malattia per ogni SCA, il che significa che sebbene il meccanismo causale sia simile l’interessamento regionale del SNC vari a secondo del tipo di SCA, come succede anche nell’Alzheimer nella diffusione transinaptica della patologia tau.
Infine, sapere almeno per SCA1 e SCA2quando iniziano i primi segni di neurodegenerazione è molto utile per verificare l’efficacia di nuovo farmaci in sperimentazione clinica di queste due patologie. 

CD33 Alzheimer’s disease locus: altered monocyte function and amyloid biology. Nature Neuroscience 2013;16:848. Studi di associazione recenti hanno individuate nove loci di suscettibilità all’Alzheimer, tra cui

CD33 and MS4A4/MS4A6E che coinvolgono il sistema immunitario nella patogenesi della malattia. L’associazione più significativa è con un marcatore (rs3865444) nel locus CD33, e alti livelli di espressione del prodotto di questo gene (una proteina transmembrana espressa sulla superficie delle cellule mieloidi progenitrici, nei monociti maturi e nei macrofagi) sono associati a un maggior declino cognitivo nei soggetti affetti. Questo allele a rischio è associato a una significativa maggior espressione di CD33 sulla superficie dei monociti circolanti in pz a età giovane o anziani con Alzheimer rispetto ai controlli, a una diminuita internalizzazione del peptide amiloide-β 42, a un accumulo patologico di amiloide nei neuriti e di amiloide fibrillare come dimostrato in vivo dalle immagini alla PET e un aumentato incremento di microglia attivata.
CD33 quindi lega la suscettibilità genetica, l’alterata funzione mieloide e la patologie amiloide a un ruolo patogenetico precoce nell’Alzheimer. Potrebbe essere quindi un nuovo target terapeutico in epoca presintomatica e potrebbe influenzare la risposta alla terapia anticorpale nelle sperimentazioni cliniche in corso.

SnapShot: Pathobiology of Alzheimer’s Diseas. Cell 2013;154:468. Istantanea dell’Alzheimer, da Cell, che fotografa in una paginetta tutto quello che si oggi, inclusa la terapia, su questa frequente e tremenda malattia.

Mutations in COQ2 in Familial and Sporadic Multiple-System Atrophy. NEJM 2013;369:233.

The Multiple-System Atrophy  Research Collaboration (duecento o più componenti in gran parte giapponesi e qualche americano) ha condotto uno studio di una rara e complessa malattia chiamata Atrofia multisistema (1969), che è una patologia neurodegenerativa progressiva caratterizzata da una variabile associazione tra segni parkinsoniani, cerebellari, autonomici (disfunzione erettile e disfunzioni vescicali) e piramidali e include entità cliniche come l’atassia olivo-ponto-cerebellare, la Degenerazione striato-negrale e la s. Shy-Drager sulla base degli aspetti neuropatologici che sono aggregati citoplasmatici di α-sinucleina. Clinicamente la patologia è stata suddivisa in diversi sottotipi, che hanno una frequenza diversa a secondo della popolazione (nei giapponesi prevale la forma C- 65%). Considerata sino a poco tempo fa come non genetica, ma per la presenza di molte famiglie con più affetti si ritiene ora che forti fattori genetici siano responsabili della suscettibilità a questa patologia.
Analisi linkage con SNP e NGS dell’intero genoma in 6 famiglie giapponesi con più affetti e in pz sporadici: 363 pz giapponesi, 223 europei e 172 nord americani con i relativi controlli. Sono stati identificati nei casi famigliari più loci associati. In due una mutazione in omozigosi/eterozigote composto di Q10, non nelle altre quattro famiglie in cui non erano presenti varianti di altri 11 geni della biosintesi di Q10. Analisi funzionali di queste mutazioni dimostrano che le varianti sono associate a bassi livelli enzimatici. Interessante il fatto che una variante comune V343A, presente solo nella popolazione giapponese con frequenza allelica del 2.2%, è un fattore di suscettibilità per la malattia ma non l’unico fattore causale perché è presente anche in persone senza malattia. Nei casi sporadici sono state trovate varianti comuni e rare, tutte con effetto sul pathway di Q10.
In conclusione i risultati suggeriscono che l’alterata attività di Q10, che influisce negativamente sulla catena respiratoria mitocondriale e aumenta la vulnerabilità a stress ossidativi, determina la suscettibilità alla Atrofia multisistema sia nei casi familiari che sporadici. Di conseguenza è consigliabile come terapia la somministrazione orale con Q10, che sappiamo ben tollerata e senza effetti collaterali, soprattutto nei pz con varianti genetiche di questo gene.

GENETICA MEDICA/UMANA (sequenziamento esonico-genomico, proteoma e CNV)

Rett syndrome mutations abolish the interaction of MeCP2 with the NCoR/SMRT co-repressor. Nature Neuroscience 2013;16:898. La s. Rett è una delle poche condizioni sindromiche causa di autismo e può aiutarci a capire i meccanismi patogenetici a livello molecolare. Il gene malattia della classica s. Rett (e della variante Zappella)(MIM #312750) è MeCP2, la cui proteina collega la metilazione del DNA con la struttura cromatinica mediando variazioni epigenetiche che modificano la funzione genomica. Sono note numerose sue interazioni proteiche ma non come queste avvengano né come le mutazioni-malattia alterino queste interazioni (vedi anche An AT-Hook Domain in MeCP2 Determines the Clinical Course of Rett Syndrome and Related Disorders. Cell 2013;152:984)(Febbraio 2013). Molte mutazioni missenso che causano il fenotipo Rett sono localizzate in un dominio di legame al DNA e questo suggerisce che questo legame è critico per la sua funzione. Nel lavoro viene identificato un altro cluster mutazionale che elimina un altro dominio funzionale di interazione tra MeCP2 e il complesso co-repressore NCoR/SMRT (proteina co-regolatoria di più fattori trascrizionali con numerosi domini), interazione critica per la repressione trascrizionale di MeCP2 e quando abolita è causa del fenotipo Rett. Il topo con una di queste mutazioni ha un fenotipo simile a quello della s. Rett dell’uomo.
In conclusione la proteina codificata da MeCP funge da ponte tra il DNA e il corepressore NCoR/SMRT e l’abolizione di questa funzione causa questa grave malattia neurologica.

Due commenti (Congenital neutropenia and VPS45. Nature Genetics 2013;45:722 e SNAREing a new cause of neutropenia. Blood 2013;121:4969) sull’identificazione del gene recessivo causa della rara sindrome congenita caratterizzata da neutropenia grave, fibrosi del midollo osseo, nefromegalia e suscettibilità a gravi infezioni batteriche (non menzionata in OMIM)(A Congenital Neutrophil Defect Syndrome Associated with Mutations in VPS45. NEJM 2013;369:54 e The Thr224Asn mutation in the VPS45 gene is associated with the congenital neutropenia and primary myelofibrosis of infancy. Blood. Pg 5078). Su Blood in due famiglie palestinesi con figli con questa sindrome tramite mappatura per omozigosità e poi sequenziamento esonico è stata identificata mutazione del gene VPS45 in omozigosi. Su NEJM stesse analisi in 4 famiglie palestinesi trovata in omozigosi in tutte la stessa mutazione missenso e un’altra mutazione, sempre missenso in una famiglia del Marocco. Le mutazioni trovate in questo gene causano un difetto del traffico intracellulare con aumentata apoptosi. La proteina VPS45 interagisce con molti componenti del pathway endocitico e secretorio e è altamente espressa nelle cellule mononucleate del sangue periferico e nei neutrofili. Interessante l’osservazione della sensibilità dei neutrofili e di altre linee ematopoietiche alle alterazioni del traffico intracellulare.

Targeted resequencing in epileptic encephalopathies identifies de novo mutations in CHD2 and SYNGAP1. Nature Genetics 2013;45:825. Le encefalopatia epilettiche sono un gruppo eterogeneo di epilessie con gravi e ripetute crisi convulsive che non rispondono all’usuale terapia associate a arresto o regressione cognitiva. Sono note mutazioni de novo di molti geni malattia e in circa l’8% sono documentabili anche anomalie del numero di copie (CNV). Per ogni gene malattia non è noto l’intero spettro fenotipico per cui i test diagnostici sono eseguiti in serie, costosi (anche come tempo di esecuzione, ndr) e inefficienti per cui nella gran parte dei casi la patologia rimane non spiegabile (e la consulenza genetica frustrante per chi la subisce e per chi la fa, ndr). Quindi gli AA hanno applicato NGS limitato a 65 geni: 19 noti e 46 candidati tra cui 33 geni associati a CNV e 13 geni causali di malattie del neurosviluppo o di altre sindromi epilettiche. La popolazione studiata è stata di 500 pz con encefalopatia epilettica di gravità variabile.

Identificata la mutazione causa della patologia nel 10% dei soggetti. In 6 dei 46 geni candidati è stata trovata 1 o più mutazioni patogene che tutte insieme interessano il 3% dell’intero campione di pz. Mutazioni de novo di CHD2 e di SYNGAP1 costituiscono una nuova causa di encefalopatia epilettica rispettivamente dell’ 1.2% e dell’1% dei casi. Dei geni noti due (SCN1A e CDKL5) sono i più frequentemente coinvolti (8 casi ciascuno), il terzo è SCN2A (con 5 casi), mentre è stata trovata una mutazione in un solo caso di geni  PNKP, PNPO, SCN8A e UBE3A (vedi Fig. 1). Nelle tabelle alcune informazioni cliniche di ciascun caso.

From mice to man: chloride transport in leukoencephalopathy. Lancet Neurology 2013;12:626. Commento dellarticolo sullo stesso fascicolo (Brain white matter oedema due to ClC-2 chloride channel deficiency: an observational analytical study. Pg. 659) in cui, sulla base dell’osservazione che nel topo con mutazione del canale del cloro (gene CLCN2, proteina CIC-2) vi è un’alterata omeostasi ionica e dell’acqua, si è voluto verificare se l’omeostasi ionica e dell’acqua sia alterata nelle leucoencefalopatia dell’uomo, patologia caratterizzata da edema della sostanza bianca, e identificare nuovi geni e nuove entità cliniche di questa patologia. Da sottolineare che nell’uomo non vi sono patologie dovute a mutazioni di questo gene.

Nel topo Clcn2^-/- compare tardivamente con vacuolarizzazione della sostanza bianca in varie regioni cerebrali con vacuoli interessanti degli strati mielinici degli assoni e con colocalizzazione di CIC-2 con la Connessina 47 (le Connessine, Cx, sono subunità proteiche che costituiscono i connessoni che sono emicanali che mediano il trasferimento di ioni attraverso la membrana cellulare); clinicamente i topi sono ciechi, hanno degenerazione testicolare ma non hanno atassia (vedi dopo). In più l’inattivazione della Cx 47, della Cx32 e del canale del potassio KCNJ10 comportano, sempre nel topo, la vacuolizzazione mielinica. Nell’ambito della patologia molto eterogenea delle leucoencefalodistrofie  gli AA hanno selezionato 7 pz (4 con sintomi a insorgenza infantile e 3 in età adulta) con anomalie (microvacuolizzazione) alla MRI della capsula interna del limbo posteriore, del peduncolo cerebrale o del peduncolo cerebellare con segni clinici di atassia, spasticità e corioretinopatia (senza cecità). Risultati con il sequenziamento esomico: mutazioni con perdita di funzione di CLCN2 in omozigosi o come composto eterozigote in 3 adulti e 3 bambini e una mutazione di GJB1, codificante la connessina 32, in un bambino.
Un altro aspetto, dice il commento, è la colocalizzazione di altri geni, come GlilCAM e MLC1, con CLCN2 nei contatti tra astrociti. Questi due geni sono causa, nell’uomo, di leucoencefalopatia megalencefalica con cisti subcorticali, anche se il quadro clinico delle tre condizioni sembra abbastanza specifico.

Genome-wide Generation and Systematic Phenotyping of Knockout Mice Reveals New Roles for Many Genes. Cell 2013;154:452. Conosciamo più di 20.000 geni codificanti proteine e altrettanti RNA non codificanti, ma ancora poco sappiamo della funzione di moltissimi geni e del loro impatto sulla salute e sulle malattie. La ricerca si è concentrata su pochi geni, ben conosciuti, ma per sfruttare appieno la conoscenza dell’intero genoma dobbiamo cercare risorse biologiche in grado di rispondere alle nostre esigenze di conoscenza. Nel lavoro viene presentato il programma del Sanger Institute Mouse Genetics Project

(http://www.sanger.ac.uk/mouseportal/) che ricorre al modello animale (topo) utilizzando il sistema delle cellule staminali con mutazione per studiare la funzione e il corrispondente fenotipo di oltre 7.000 geni. Dei 50 geni ortologhi dell’uomo (riportati in OMIM), la metà dei mutanti ha un fenotipo consistente con quello umano, ma con segni clinici nel topo non ancora segnalati nell’uomo. Molti geni di malattie recessive in omozigosi sono letali nel topo e 26 geni su 59, mutati nel topo sono descritti per la prima volta.
Un’utile fonte di informazioni per conoscere la funzione di geni di cui sappiamo poco o nulla.

Delayed Puberty and Estrogen Resistance in a Woman with Estrogen Receptor α Variant. NEJM 2013;369:164. Mutazioni del gene recettore degli androgeni causa nei soggetti 46,XY una resistenza che può essere completa agli androgeni che comporta genitali esterni femminili e testicoli ritenuti. Lo stesso nel modello murino. Sono molto rare mutazioni del recettore degli estrogeni, la cui azione è mediata da due recettori (α e β). L’estradiolo (principale ormone estrogeno prodotto dalle ovaie) influenza lo sviluppo mammario e il feedback dall’ipotalamo e ipofisi coinvolge il recettore α. Vi è un’unica descrizione di mutazione del gene che codifica tale recettore (ESR1) in un maschio. Questa è la prima descrizione di mutazione in una donna con mancato sviluppo di tessuto mammario, elevati livelli ematici di estrogeni e ovaie multicistiche. La pz ha un mutazione con perdita di funzione in omozigosi del gene ESR1 in un residuo altamente conservato che interferisce con il segnale estrogenico e che provoca in lei una grave resistenza agli estrogeni. Il topo femmina KO di Esr1ha utero ipoplasico, ovaie multicistiche senza corpo luteo e è sterile, mentre il maschio ha solo una ridotta fertilità. Nel topo femmina l’ablazione di Esr1 (codificante il recettore β) comporta solo modesta riduzione della follicogenesi e neonati di piccole dimensioni.

CRESTing the ALSmountain. Nature Neuroscience 2013;16:774. Commento di un articolo sullo stesso fascicolo (Exome sequencing to identify de novo mutations in sporadic ALS trios. Pg. 851). La sclerosi laterale amiotrofica, grave malattia neurodegenerativa  nel 10% è familiare con alcuni geni malattia noti (vedi Selezione Articoli interesse Aprile 2013 e precedenti) e con causa genetica negli sporadici in gran parte dei casi non identificabile. E allora (come scontato, ndr) si fa l’esoma dei pz sporadici (n° 47)  C9orf72 negativi  e dei loro genitori e si vanno a cercare le mutazioni de novo. Risultato:  mutazioni particolarmente frequenti nei geni codificanti regolatori cromatinici, tra cui il regolatore cromatinico SS18L1 (noto anche come CREST) in un pz, la cui mutazione causa una proteina più corta e sembra patogena. L’analisi estesa a 62 casi familiari di ASL ha identificato una mutazione missenso di CREST. Studi funzionali dimostrano che la proteina mutata causa una disfunzione neuronale,  che la normale proteina codificata interagisce in vivo con Fus (gene mutato nel 4% dei casi di ASL familiari)(ALS 6, MIM #608030) e che CREST  contiene domini prion-like (l’ipotesi di una diffusione simile a quella di infezione da prioni riguarda molte malattie neurodegenerative, incluso Alzheimer). Ci sono ancora molti aspetti da chiarire, ne cito (da clinico, ndr) solo uno: nei casi familiari ora si identifica la base genetica in 2/3, ma solo nell’11% degli sporadici si identifica il gene malattia. Il suggerimento quindi di studiare l’esoma di tutti gli sporadici in modo da verificare se vi siano mutazioni o geni ricorrenti.

Somatic Mutation, Genomic Variation, and Neurological Disease. Science 2013;341:43 e Somatic Mutation, Genomic Variation, and Neurological Disease. Science 5 July. Le mutazioni somatiche che si producono nel corso dello sviluppo cerebrale in epoca prenatale e che causano malattie neurologiche, anche con mosaicismo a basso livello, provocano malformazioni cerebrali, talora associate a epilessia e deficit cognitivo. Un esempio recente è costituito dalla s. Proteus o dalla Megalencefalia-malformazione dei capillari  in cui recentemente è stata dimostrata una mutazione di alcuni geni (PIK3CA, AKT3, and mTOR)(AKT3, PIK3R2 and PIK3CA cause a spectrum of related megalencephaly syndromes. Nature Genetics 2012;44:934)(De novo somatic mutations in components of the PI3K-AKT3-mTOR pathway cause hemimegalencephaly. Nature Genetics 2012;44:941)(Articoli Agosto 2012). La mutazione può non essere presente nel sangue periferico ma solo a livello cerebrale e causare ampi difetti anatomici, anche se solo l’8-35% delle cellule portano la mutazione, dimostrando che l’effetto mutazionale non è proporzionato alla sua frequenza. La Review, in modo molto didattico, presenta vari aspetti delle patologie con mosaicismo genetico: How Do Somatic Mutations Manifest as Neurological Disease, “Second Hit” Mutations Produce Mosaicism Neurodevelopmental Disorders Caused by Somatic Mutations (es. Sclerosi Tuberosa), “Brain-Only” Somatic Mutations (vedi esempio sopra riportato delle sin dromi Megalencefalia-malformazioni dei capillari), Neurodegenerative Diseases Caused or Modulated by Somatic Mutation (l’esempio della mutazione DCX, gene XL, che causa nel maschio lissencefalia in quanto il prodotto è responsabile della migrazione neuronale, mentre nella femmina, mosaico naturale con cellule con e cellule senza mutazione, si produce un quadro intermedio di eterotopia con “doppia corteccia”), How Does Cortical Clonal Architecture Influence Mosaic Mutations (l’architettura clonale dell’encefalo può contribuire a determinarne un’anomalia di sviluppo che dipende dal tipo di cellula interessata perché  una specifica cellule progenitrice in cui avviene una mutazione somatica trasmette la mutazione alle cellule figlie), Other Neurological Diseases Attributable to Somatic Mutation, Contribution to Functional Cellular Diversity in the Brain, Techniques for Further Study of Somatic Variation in the Brain (come quelle che studiano il genoma di singoli neuroni, che promettono di rispondere a alcuni quesiti mediante l’analisi sistematica di tutti i tipi di mutazione somatica nel tessuto normale e in quello con anomalie di sviluppo).

Genome Mosaicism—One Human, Multiple Genomes. Science 2013;341:358. Una Perspective  di  James R. Lupski sull’origine e sul significato del mosaicismo, sia come evento fisiologico (l’utilità di una diversità genetica generata da ricombinazioni e ipermutazioni somatiche per combattere la grande varietà di patogenesi e antigeni) che patologico.

Sequencing studies in human genetics: design and interpretation. Nature Reviews Genetics 2013;14:460.  La differenza tra la tecnica di analisi di associazione dell’intero genoma (GWAS) e il sequenziamento di nuova generazione dell’intero genoma (NGS) è che mentre GWAS individua regioni che influenzano il rischio di malattie complesse e quindi varianti indirettamente causali, NGS identifica direttamente le varianti causa di malattia, che per queste patologie possono essere rare e multiple.

Nello stesso tempo il Genetista Clinico sta applicando NGS per ovviare all’inefficacia dei comuni test genetici di cui dispone nella pratica clinica. Quindi il sequenziamento dell’intero genoma sta diventando lo strumento per identificare le basi genetiche delle malattie dell’uomo ma con considerevoli difficoltà applicative. Mentre per GWAS è possibile applicare tecniche statistiche e stabilire la soglia di significatività di associazione tra variante e malattia, questo non è applicabile per NGS per il semplice motivo che non si possono considerare tutte le varianti trovate come ugualmente probabili come causa, almeno per il momento.
E’ stata da alcune recenti review sottolineata la potenziale utilità di NGS sia per i caratteri complessi che per le malattie mendeliane, ma anche il rischio di considerare come causali varianti genetiche con debole associazione a malattie. In questa review viene presentata la procedura di interpretazione dei dati della NGS considerando come escono i dati, come vengono classificate e considerate le varianti e come valutare la funzione di varianti candidate tenendo conto dell’evidenza statistica di associazione.

Loss of Function of the Melanocortin 2 Receptor Accessory Protein 2 Is Associated with Mammalian Obesity. Science 2013;341:275.  I recettori della melanocortina (MCR) sono una sottofamiglia di recettori associati alla proteina G (GPCR) che modula le risposte cellulari a numerosi stimoli fisiologici, come la risposta a peptidi derivati dal pro-ormone pro-opiomelanocortin (POMC) dal cui processamento a livello ipofisario si produce ACTH e αMSH (melanotropo) e i loro antagonisti, agouti e proteina aguti-correlata. MCR mediano varie funzioni: MC1R la pigmentazione cutanea, MC2R la funzione dell’asse ipotalamo-ipofisi-surrenalico, MC3R e MC4R l’omeostasi energetica e MC5R la funzione esocrina. Ma ci sono proteine accessorie che modulano le funzioni di GPCR, come la proteina accessoria di MC2R (MRAP) che è richiesta per il trafficking di MC2R dal reticolo endoplasmico alla superficie cellulare delle cellule surrenaliche e per i segnali di risposta a ACTH. La perdita di MC2R o di MRAP determina una grave resistenza all’ACTH con deficit di glucocorticoidi (MIM #202200 per MC2R, MIM #607398). E’ noto in tutti i mammiferi un gene paralogo (i geni paraloghi sono geni omologhi derivanti da duplicazione, che codificano proteine con funzioni simili ma non uguali)(MRAP2) che come MC3R e MC4R è prevalentemente espresso nell’encefalo (ponte, cervelletto, ipotalamo, tronco encefalico) e il cui mRNA è co-espresso in molte cellule con MC4R.  Cosa produce la delezione di MRAP2? Nel topo la delezione nell’intero organismo e la delezione in sede specifica cerebrale provoca grave obesità in età precoce; la proteina MRAP2 interagisce con MC4R (proteina nota dell’obesità nei mammiferi) e si ritiene che l’alterazione di segnale di Mc4r che si osserva nel topo deleto sia la causa dell’obesità. L’analisi mutazionale di MRAP2 ha individuato una mutazione in eterozigosi con le caratteristiche di patogenicità in 4 su quasi 550 bambini o adolescenti di etnie diverse e con BMI + 3/+4 DS (coorti Genetics of Obesity Study  e Swedish obese children’s).

Developmental Control of the Melanocortin-4 Receptor by MRAP2 Proteins in Zebrafish. Science 2013;341:278. Che fa MRAP2 nello zebrafish? Sappiamo, dicono gli AA, che MC4R interagisce con MRAP2 in vitro, ma non sappiamo cosa fa in vivo. Una sua forma larvale, MRAP2a, stimola la crescita del pesciolino bloccando MC4R. In vitro questa proteina lega MC4R e riduce la capacità di legame con il suo ligando, l’ormone melanotropo  αMSH. La sua forma espressa più tardi nello sviluppo, MRAP2b, lega MC4R e aumenta l’affinità tra ligando e recettore. Quindi la proteina MRAP2a stimola la crescita mentre MRAP2b aumenta la sensibilità all’ormone melanotropo quando lo zebrafish inizia a nutrirsi aumentando la capacità di regolare nutrizione e crescita.

MALATTIE COMPLESSE/STUDI ASSOCIAZIONE

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A functional variant in the CFI gene confers a high risk of age-related macular degeneration. Nature Genetics 2013;45:813. La degenerazione maculare è la principale causa di cecità negli anziani. Gli studi GWAS hanno identificato varianti comuni predisponenti che spiegano oltre la metà della sua ereditabilità. Da qui l’ipotesi che una parte della predisposizione sia dovuta a varianti rare e altamente penetranti. Lo studio riguarda un gene, CFI, che codifica una serino-protease (Fattore I -FI), presente nel siero in forma inattiva e, quando attivata, inattiva l’intero pathway del complemento. Varianti rare di CFI predispongono alla sindrome uremico-emolitica atipica (vedi selezione di articoli di Giugno e Maggio 2013) e al Lupus eritematoso sistemico. L’ipotesi di coinvolgimento di CFI nella degenerazione maculare è stata sollevata da studi GWAS che dimostrava una significativa associazione con un segmento che comprendeva gli ultimi due esoni di CFI e i geni adiacenti PLA2G12A (Phospholipase A2, Group XIIA) e CCDC109B (Coiled-Coil Domain Containing 109B). Lo studio chiarisce quali dei tre geni sono coinvolti nella degenerazione maculare. Tramite sequenziamento di CFI di 84 pz non correlati sono state trovate 2 varianti (missenso) in Hz in 4 soggetti (in tre la stessa Gly119Arg, l’altra è presente anche in altri 3 affetti della stessa famiglia del 4° pz) assenti nei controlli. In vitro e in vivo è stato dimostrato che la mutazione Gly119Arg riduce l’attività di FI. Nello zebrafish infatti questa variante altera la regolazione dei vasi retinici e la loro ramificazione. Si conferma qui di l’ipotesi che mutazioni altamente penetranti partecipino a causare la degenerazione maculare. Test predittivi sono già sul mercato usando le varianti note ma a bassa capacità predittiva, ma non sono applicabili per pz con rare varianti a alta penetranza che potrebbero essere comprese nel test predittivo, soprattutto per la familiarità a esse collegata. Sperimentazioni cliniche nell’inibire selettivamente l’attivazione del complemento sono in fase 2, ma il farmaco usato (Eculizumab, inibitore di C5)(usato anche nelle sindromi uremico-emolitiche atipiche) non sembra avere gli effetti sperati, forse anche per l’eterogeneità delle cause genetiche della degenerazione maculare (il farmaco potrebbe essere più efficace ad es. nel caso di mutazioni di CFI in cui è provata l’azione inibitoria della proteina selvatica sul complemento).

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Pleiotropy in complex traits: challenges and strategies. Nature Reviews Genetics 2013;14:483. Pleiotropia= effetti fenotipici multipli di un gene. Negli ultimi 7 anni con studi di associazione genetica GWAS sono stati identificati più di 8.500 associazioni significative per oltre 350 caratteri compressi tra cui molte malattie soprattutto autoimmunitarie, cancro e neuropsichiatriche. E molti loci hanno varianti (sia SNP che CNV)(Tab. 1) associate a malattie diverse, talora fenotipicamente differenti; queste associazioni sono chiamate associazioni cross-phenotype (CP). Es. PTPN22  per malattie autoimmunitarie (l’artrite reumatoide, m. Crohn, Lupus eritematoso sistemico) e Diabete 1. D’altra parte questo conferma quanto noto che alcune malattie condividano alcune cause genetiche (Diabete 1 e malattia tiroidea autoimmunitaria nella stessa persona). Nella Review si presentano le modalità dell’effetto pleiotropico (bella e lineare – da lezione- la Fig. 1 di pleiotropia biologica, mediata e spuria), la metodologia statistica da applicare per l’identificazione e la caratterizzazione  delle CP, le caratteristiche funzionali e le implicazioni cliniche del CP. Lo scopo è di interpretare i fenotipi come una serie di manifestazioni correlate di meccanismi biologici piuttosto che considerali come eventi isolati.

Genome-wide association study of multiple congenital heart disease phenotypes identifies a susceptibility locus for atrial septal defect at chromosome 4p16. Nature Genetics 2013;45:822. Le malformazioni cardiache (CHD) hanno un frequenza si 0.7% nati vivi e sono un’importante causa di morbilità e mortalità infantile. In un quarto dei casi si riesce a identificare la causa (cromosomica, mendeliana, CNV, teratologica). Nei rimanenti casi, sporadici, è rilevabile una predisposizione documentabile con una importante ereditabilità per la quale non ci sono spiegazioni. E’ stata quindi condotta un’analisi di associazione mediante GWAS per individuare i fattori di rischio in un ampio campione (quasi 2.000) di affetti da CHD (difetti settali, ostruttivi o cianotici) con più di 5.000 controlli.

L’analisi ha individuato una significativa associazione tra Difetto del setto interatriale e SNP in 4p16, vicino ai geni MSX1e STX18 che conferisce un rischio attribuibile , che misura l'impatto che ha sulla popolazione in studio, del 9%.

A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations. Nature Genetics 2013;45:818. GWAS nel principale gruppo etnico cinese, con più di 4200 pz e 5.100 controlli. Due associazioni significative: in 1p12 con OR di 1.40 vicino a TBX15 (fa parte della famiglia di geni T-box che codificano fattori di trascrizione che regolano una varietà di processi di sviluppo, mutazione in omozigosi causano una malattia scheletrica - s. Cousin), fa parte e in 4q31.1 con OR di 1.40 nel gene MAML3 (importante componente nel periodo della organogenesi del sistema di segnale Notch).

Using Extended Genealogy to Estimate Components of Heritability for 23 Quantitative and Dichotomous Traits. PLOS Genetics May 2013; 9:e1003520 (commento Heritability estimates. commentato su Nature Genetics 2013;45:722). Gli AA sinteticamente precisano: Phenotype is a function of a genome and its environment. Heritability is the fraction of variation in a phenotype determined by genetic factors in a population. Hanno volute verificare quello che è riportato in letteratura studiando con analisi GWAS e utilizzando il database genealogico in 38.167 islandesi l’ereditabilità di 23 fenotipi complessi, rilevanti dal punto di vista medico, di cui 11 quantitativi e 12 caratteri dicotomici. Hanno ottenuto per alcuni fenotipi valori più bassi rispetto alla letteratura in cui spesso basati su paragoni tra individui strettamente correlati. Il metodo adottato dagli AA utilizza un approccio basato sulla identità per discesa (IBD) che permette di stimare l’ereditabilità indipendentemente dalla relazione tra individui.

In base allo studio la condivisione dell’ambiente ha un considerevole effetto sulla eccessiva stima dell’ereditabilità. Infine gli AA riferiscono che i in base ai loro risultati  l’uso delle comuni piattaforme SNP è in grado di identificare per i caratteri quantitativi più della metà dell’ereditabilità, più di quanto atteso in base ai risultati della letteratura.

Identification of multiple risk variants for ankylosing spondylitis through high-density genotyping of immune-related loci. Nature Genetics 2013;45:730. L’artrite infiammatoria della spondilite anchilosante causa dolori e rigidità e determina la neoformazione ossea e fusione (anchilosi) delle articolazioni colpite. Interessa lo 0.55% della popolazione di origine europea e lo 0.23% della popolazione cinese, mentre è molto rara nella popolazione africana e giapponese, data la bassa prevalenza dell’antigene di superficie HLA-B*27, codificato dal locus maggiore di istocompatibilità, nota variante associata alla spondilite anchilosante, che è molto spesso familiare con ereditabilità di >90%. Oltre l’80% dei casi ha l’allele HLA-B*27 allele, anche se solo l’1-5% dei portatori di questo allele sviluppa la patologia, la cui suscettibilità quindi dipenda da altri fattori genetici. Sono infatti note molte altre varianti predisponenti. 

Sono presentati  i risultati di Immunochip Consortium che ha sviluppato un microarray SNP dedicato (Immunochip) nell’ambito dell’analisi genome-wide association study (GWAS) in 10.619 casi e 15.145 controlli in discendenti europei, asiatici e latino-americani per identificare nuovi loci associati.
Confermata l’associazione di 12 dei 13 loci già noti e identifica un’associazione significativa con altri 13 loci. Si conferma il contributo nella patogenesi della spondilite anchilosante dell’alterato processamento peptidico prima della presentazione di HLA-I e dell’alterato pathway della Interleuchina-23.

High-density genotyping study identifies four new susceptibility loci for atopic dermatitis. Nature Genetics 2013;45:808. La dermatite atopica è una commune malattie cutanea infiammatoria con alta ereditabilità la cui patogenesi si ritiene sia legata a difetti di differenziazione cheratinocitica e di anomalie immunitarie con autoreattività. Il gene FLG, codificante la filaggrina (presente nelle cellule dello strato granuloso, che è l’ultimo strato di cellule vive, che ha la funzione di aggregare in fasci spessi le tonofibrille (wiki), è il locus principale dei difetti di barriera cutanea, ma sono stati identificati tramite GWAS altri loci predisponenti. Utilizzando l’array Immunochip (vedi sopra) in un’ampia popolazione europea, cinese e giapponese è stato possibile identificare altri 4 loci, con un totale di 11 considerati quelli già noti, che spiegano il 14.4%  dell’ereditabilità della dermatite atopica.

Pitfalls of predicting complex traits from SNPs. Nature Reviews Genetics 2013;14:507. L’applicazione della tecnica GWAS ha consentito di prevedere l’effetto fenotipico di caratteri complessi, incluse le malattie, in base ai dati genetici. Questa review pone note di cautela e alcune limitazione in questa “predizione”, con il rischio, se si affronta questa tecnica in modo non appropriato, di interpretare incorrettamente i dati e quindi sbagliare nella previsione fenotipica.

TERAPIA-SPERIMENTAZIONE

A secreted PTEN. Nature Genetics 2013;45:722. Commento di un articolo (molto interessante, per gli aspetti terapeutici anche in sindromi genetiche non solo nei tumori)

(Science http://www.sciencemag.org/content/early/recent) su una isoforma naturale di PTEN, chiamato PTEN lungo, che antagonizza il pathway  PI3K, che contiene altri 173 aminoacidi rispetto alla proteina normale. Questa isoforma è secreta dalle cellule e riduce esternamente il segnale PI3K. L’iniezione intraperitoneale della proteina PTEN lunga nel topo portatore di tumori derivati da diverse linee tumorali umane ha portato a una regressione del tumore stesso. Gli AA suggeriscono che PTEN lungo ricombinante possa essere usato nel controllare in clinica il pathway PI3K (es. Mutations in STAMBP, encoding a deubiquitinating enzyme, cause microcephaly–capillary malformation syndrome. Nature Genetics 2013;45:556)(Articoli Maggio 2013)( Postzygotic HRAS and KRAS mutations cause nevus sebaceous and Schimmelpenning syndrome. Nature Genetics 2012;44:783)(Articoli Luglio 2012).

Vedi anche:

Where Is PTEN? Science 2013;341:355.
Nuclear PTEN Controls DNA Repair and Sensitivity to Genotoxic Stress. Science 2013;341:395.
A Secreted PTEN Phosphatase That Enters Cells to Alter Signaling and Survival. Science 2013;341:399.

DIAGNOSI PRENATALE

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Genomic testing reaches into the womb. Nature Biotechnology 2013;31:595. Vedi anche (Competition intensifies over DNA-based tests for prenatal diagnoses. Nature Medicine 2013;19:381)( Non-invasive prenatal measurement of the fetal genome. Nature 2012;487:320)(Blood test for Down syndrome. Nature Biotechnology 2012;30:380)(From prenatal genomic diagnosis to fetal personalized medicine: progress and challenges. Nature Medicine 2012;18:1041) citati nelle precedenti Spigolature o Articoli interesse.

La diagnosi prenatale non invasiva (NIPD) per le anomalie cromosomiche messa sul mercato nell’Ottobre del 2011 ha avuto un incredibile successo applicativo in tutto il mondo. La NIPD è rimasta una chimera per decenni, ma l’individuazione alla fine degli anni ’90 di un’abbondante quantità di DNA fetale libero nel plasma materno (cffDNA) ha reso possibile quello che riteneva non possibile, cioè l’analisi precoce (sin dalla 7sg)(in genere eseguita tra le 9 e le 10sg) di anomalie cromosomiche con test a altissima sensibilità (>99%) e con falsi positivi vicino allo zero, con risposta in una settimana e a costi contenuti (da poche centinaia di D USA a 1.550)(le differenze dipendono dalla tecnica usata) utilizzando NGS. Tanto che l’American College of  Obstet & Gynecol nel Novembre 2012 l’ha consigliata come test da applicare alle gravidanze a rischio di anomalie cromosomiche. Una compagnia (Natera, San Carlos, CA) ha sviluppato la tecnica anche per applicarla alla diagnosi preimpainto. Ma data la frequenza di CNV patologiche identificabili con array-CGH nei nati (1.7%)(NEJM 2012; 367, 2175)(Vedi Articoli Dicembre 2012) è possibile che la DP sia applicata in tutte le gravidanze. In questo caso si sta cercando di verificare se sia possibile analizzare la diagnosi prenatale non invasiva con la tecnica in uso, che è il sequenziamento massivo con tecnica shotgun (MPSS) o ricorrendo all’analisi degli eritrociti nucleati fetali. Ma “It remains to be seen if noninvasive prenatal testing can fulfill its considerable technical potential in an ethical and socially positive manner” (questo riguarda l’aspetto tuttora discusso se l’analisi di CNV submicroscopici, con i limiti di interpretabilità che ci sono, sia da applicare a tutte le gravidanze, ndr).

Il sequenziamento dell’intero genoma fetale da NIPD è tecnicamente già possibile (Nature 2012;487:320), ma non sembra che per ora sarà applicato a fini diagnostici per le difficoltà interpretative che comporta (e gli attuali costi).