Articoli Genetica Clinica/Umana Maggio 2014. R. Tenconi

Scelta di articoli di Genetica Clinica/Umana pubblicati in Maggio 2014 nelle seguenti riviste: British Medical Journal, Lancet, Lancet Neurology, Nature, Nature Biotechnology, Nature Genetics, Nature Medicine, Nature Neuroscience, Nature Reviews Genetics, Nature Reviews Neuroscience, NEJM, PNAS, Science & Cell.

 

AUTISMO - M. PSICHIATRICHE

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Multivariate analysis reveals genetic associations of the resting default mode network in psychotic bipolar disorder and schizophrenia. PNAS 2014;111:E2066. Da recenti studi usando una nuova strategia di identificazione di pathway comuni in specifiche patologie risulta che sono coinvolti sia nella schizofrenia (SZ) che nel disturbo bipolare (BP) geni di adesione neuronale, della formazione sinaptica e del segnale cellulare e nella SZ pathway della guida assonica, della mobilità neuronale e della funzione sinaptica. Solo una minima parte di casi la patologia è dovuta a rare mutazioni altamente penetranti come CNV, nella mx parte dei casi si ritiene sia dovuta all’interazione di  più geni, ognuno con un piccolo effetto. Per potenziare gli studi di associazione, data l’ampia variabilità fenotipica e le difficoltà diagnostiche si cercano endofenotipi (marker interno intermedio tra gene e fenotipo) come alcuni ricavabili dalla resting-state fMRI.

Lo scopo di questo complesso lavoro è di provare nei probandi un’alterata connettività in specifiche aree cerebrali, di osservare, data l’alta ereditabilità, simili alterazioni nei loro consanguinei di 1° grado e di verificare l’associazione con specifici gruppi di geni, quelli già precedentemente segnalati come coinvolti in queste patologie in base alla classificazione endofenotipica. Come in realtà è stato provato.

 

Variant GADL1 and Response to Lithium in Bipolar I Disorder. NEJM 2014:370:1855. Lettere all’Editore molto critiche sull’articolo Variant GADL1 and Response to Lithium Therapy in Bipolar I Disorder. NEJM 2014;370:119 (vedi selezione aritcoli Gennaio 2014).

 

Is the prevalence of autism increasing in the United States? BMJ 2014;348:g3088. Commento sui risultati del documento dei Centers for Disease Control and Prevention (Prevalence of autism spectrum disorder among children aged 8 years—Autism and Developmental Disabilities Monitoring Network, 11 sites, United States, 2010. MMWR Surveillance Summaries . 2014;63:1-21)(vedi News Autism diagnoses in the US rise by 30%, CDC reports. BMJ 2014;348:g2520). Il commento, che sottolinea le limitazioni di questi studi, si pone la domanda: So what might this latest report mean for those who diagnose and care for children with autism spectrum disorder? Primo: diagnosi tardiva (44% sottoposti a una completa valutazione entro i 3 anni e il 36% l’hanno dopo i 4 anni). Secondo: vengono sempre più identificati bambini con capacità cognitive nella media o superiori alla media e le strutture che si occupano di autismo sono dedicate a bambini con anche deficit cognitivo. Altro punto incontestabile: “But is autism spectrum disorder truly crossing the “epidemic” threshold or are we just counting children differently?” (giustissimo, ndr).

Altered global brain signal in schizophrenia. PNAS 2014;111:7438. Studiando con MRI cerebrale funzionale 161 pz con schizofrenia, 73 con disordine bipolare e 220 controlli sono state individuate nei soli pz cob schizofrenia alterazioni compatibili con alterata connettività generalizzata.

 

MALATTIE NEUROLOGICHE/NEURODEGENERATIVE

Mutations in the Matrin 3 gene cause familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature Neuroscience 2014;17:644. La Sclerosi Laterale Amiotrofica è una malattia neurodegenerativa per la quale non ci sono cure e che causa paralisi e morte. La base patogenetica è l’accumulo, come risultato finale, di inclusioni ubiquinate citoplasmatiche della proteina legante RNA, TDP-43 localizzate in “granuli da stress”, che sono ritenuti un meccanismo protettivo durante lo stress cellulare. Mutazioni missenso di TDP-43 (transactive response DNA binding protein) causano aggregati TDP-43 nell’1-5% dei casi familiari di ALS (che sono il 10% delle ALS). MATR3 è una proteina legante sia RNA che il DNA che interagisce con TDP-43. L’analisi dell’esoma in una famiglia con più membri affetti ha individuato una missenso del gene MATR3, che codifica una proteina legante RNA e DNA che interagisce con TDP-43.

Il decorso è caratterizzato da una progressiva insufficienza respiratoria che porta a morte dopo 15 anni di malattia, i pz hanno riflessi osteotendinei a scatto agli arti inferiori e segni clinici di lesioni delle corna anteriori del midollo spinale. L’analisi del gene in altri pz ha consentito di individuare in 1:108 casi familiari (inclusi pz italiani) e in 1:96 pz inglesi mutazioni missenso diverse. L’analisi immunoistochimica con MATR3 a livello del midollo spinale mostra una quadro patologico di MATR3 sia in coloro che portano una mutazione di questo gene sia in coloro in cui MATR3 non è mutato. Ulteriore prova dell’anomalo processamento dil RNA nella degenerazione del motoneurone.

TDP2 keeps the brain healthy. Nature Genetics 2014;46:419 commento e articolo TDP2 protects transcription from abortive topoisomerase activity and is required for normal neural function. Pg. 516. Molte malattie da riparazione del DNA hanno, per motivi non precisati, una grave disfunzione neurologica. Nello studio si documenta una sulla funzione neuroprotettrice di una fosfodiesterasi, TDP2,

che sembra avere un ruolo chiave per la prevenzione di rotture di DNA da alterata attività topoisomerasica II.

In una famiglia irlandese di consanguinei con 3 fratelli con encefalopatia epilettica ed atassia è stata trovata una mutazione inattivante in omozigosi del gene TDP2 tramite linkage, mappa di omozigosità e sequenziamento esomico targeted. In un altro pz egiziano non correlato, con fratelli affetti da un’analoga condizione, è stato trovata un’altra mutazione, sempre in omozigosi, dello stesso gene. Con studi in vitro si dimostra un effetto protettivo trascrizionale per alcuni geni dello sviluppo neuronale da parte di TDP2 che agisce sull’attività endogena abortiva di TOP2, attività che ha un importante effetto patogeno sui neuroni.

Astrocytes go awry in Huntington’s disease. Nature Neuroscience 2014;17:641. Commento dell’articolo sullo stesso fascicolo (Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington’s disease model mice. Pg. 694) che suggerisce che la disfunzione neuronale sia dovuta, contrariamente a quanto sinora ritenuto di un processo interessante i neuroni, all’effetto della huntigtina mutata sugli astrociti che provoca una downregulation di un importante canale del potassio negli astrociti dello striato con conseguente danno eccitotossico dei circuiti neuronali.

Neuronal targets for reducing mutant huntingtin expression to ameliorate disease in a mouse model of Huntington’s disease. Nature Medicine 2014;20:536. Ci si chiede perché pur essendo la huntingtina mutata (mHTT) espressa in ogni cellula, questa causi solo una neurodegenerazione selettiva a livello corticale e dello striato. Usando un modello murino transgenico condizionale si dimostra che la riduzione di espressione della mHTT a livello solo corticale migliora parzialmente le anomalie motorie e comportamentali ma non la neurodegenerazione, mentre la riduzione di espressione nella corteccia e nello striato migliora considerevolmente la sintomatologia comportamentale e l’atrofia cerebrale selettiva. In più la ridotta espressione della proteina mutata nello striato o nella corteccia migliora i difetti sinaptici corticali e dello striato, ma si ha un effetto ancor più evidente se si riduce l’espressione di mHTT in ambedue le sedi.

I risultati suggeriscono che terapie mirate a ridurre l’espressione di mHTT devono, per avere maggior effetto, agire sui neuroni sia corticali che dello striato.

Single App knock-in mouse models of Alzheimer’s disease. Nature Neuroscience 2014;17:661. Sinora il fenotipo Alzheimer indotto nel topo da sovraespressione del precursore amiloide beta era influenzato dal fatto che oltre alla sovraespressione di peptide β-amiloide peptide (Aβ), che è il principale componente delle caratteristiche placche cerebrali dell’Alzheimer, sono sovraespressi altri frammenti del precursore. Nel lavoro sono stati generati topi knock-in con umanizzazione della sequenza Aβ e inserite diverse mutazioni con effetti diversi del clivaggio della proteina precursore. L’effetto fenotipico è quello di una tipica patologia Aβ, neuroinfiammazione e un difetto di memoria età dipendente.

NGS/GENETICA UMANA/CLINICA

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The Hunt for Missing Genes. Science 2014; 344:687. Sottotitolo molto efficace: Identifying healthy human “knockouts”—people completely lacking a specific gene—may suggest new biomedical treatments. L’esperienza insegna che trovare perdita di funzione di ambedue gli alleli di un gene la cui carenza è compatibile con una nuova malattia non è la prova sufficiente che questo sia la causa della malattia. Ora si sa che circa il 16% della popolazione ha inattive ambedue gli alleli di un gene senza alcun effetto clinico, che ognuno di noi ha in media 20 geni KO e che sempre in media ognuno di noi ha 100 geni inattivabili senza apparente effetto clinico. E’ un esperimento naturale da studiare, stimolante per la ricerca (ad es. per proporre nuove terapie), e non risolvibile con il KO di geni nel topo e vedere l’effetto che fa perché non è possibile tracciare una stretta relazione topo-uomo. Bella tabella con 5 esempi, tra cui il noto gene CCR5, recettore di superficie cellulare, la cui assenza protegge dall’infezione HIV, presente nell’1% della popolazione europea del nord, che suggerisce per questa infezione il ricorso a farmaci molecolari o il trapianto di staminali modificate.

L’altro esempio è il PCSK9 (vedi selezione Aprile 2003: A gene of rare effect. Nature 2013;496:152 che descrive una donna di 40 anni afro-americana con livelli di LDL di 14 mg/dL (vn 100) con due mutazioni inattivanti ereditate dai genitori di PCSK9, una serin proteasi che riduce LDL epatico e extraepatico e che aumenta i suoi livelli nel sangue); da questo è seguita una sperimentazione clinica con un suo inibitore che ha dato ottimi risultati (riduzione di oltre il 57% dei livelli di colesterolo).

Molti riguardano geni dell’olfatto o simili di cui ci sono nel genoma copie multiple.

La ricerca prosegue in popolazione isolate, si stanno identificando nuovi geni, come LPA che codifica una lipoproteina implicata nella malattia cardiovascolare e le persone KO hanno un significativo minor rischio per queste patologie. Ma è possibile anche sfruttare l’effetto opposto: se il KO di un gene causa una malattia, come l’insensibilità al dolore (SCN9A)(vedi selezione articoli Novembre 2013:A de novo gain-of-function mutation in SCN11A causes loss of pain perception. Nature Genetics 2013;45:1399), usare questo dato per trovare nuovi farmaci contro il dolore.

Una raccomandazione finale: “We think the key is to have an outstanding, centralized database, that contains

systematic phenotypic information in each human knockout” (già la clinica che torna a contare, ma chi la fa e chi la controlla nel tempo? Ndr).

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Family history wins gene debate. Nature 2014;509:403. Social network genetico con commenti di  una relazione ad un convegno sulla biologia dei genomi a Cold Spring Harbor ai primi di Maggio. Un commento dice “Your genome is a better record of your family history than your family”. Un altro riporta alla luce un articolo di 5 anni fa (Predicting human height by Victorian and genomic Methods. EJHG 2009;17:1070) in cui si sosteneva che per caratteri altamente ereditabili come la statura vale ancora il metodo galtoniano del 1886 (when dealing with the transmission of stature from parents to children, the average height of the two parents, … is all we need care to know about them) per accuratezza e e costi. Insomma, dice il commento, “a simple average of the parents’ heights could predict a person’s height better than a genetic profile of 54 locations along the genome”.

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Rare inherited kidney diseases: challenges, opportunities, and perspectives. Lancet 2014;383:1844. Fascicolo quasi interamente dedicato alle patologie renali e al trapianto di rene (Seizing the opportunity to rethink renal research. Lancet 2014;383:1782). Tra le varie note-commenti e articoli segnalo Rare inherited kidney diseases: challenges, opportunities, and perspectives. Lancet 2014;383:1844. Review (un A è italiano, Mario Negri BG) che sottolinea che il 10% degli adulti e la quasi totalità dei bambini che ricevono un trapianto hanno una malattia ereditaria. Elencate molto bene in Tab. 1 e classificate le varie condizioni sindromiche e non, che sono causa di anomalia di crescita e di struttura dei reni, incluso lo sterminato numero delle ciliopatie e in Tab. 2 le malattie di alterata funzione renale.

Vengono discusse anche le opportunità diagnostiche prognostiche e terapeutiche ricorrendo alla tecnologia “omica”. E infine le possibilità terapeutiche dal 1981 (cisteamina per la cistinosi) al 2013 con la prima sperimentazione clinica con octreotide a lento rilascio per la malattia policistica renale AD. Ottimo.

Vedi anche website of the Working Group on Inherited Kidney Diseases (http://www.era-edta.org/wgikd/ERA-EDTA_working_group_on_Inherited_kidney_disorders.htm).

Spinocerebellar ataxia type 2: progression before diagnosis. Lancet Neurology 2014;13:445. Commento di una studio longitudinale pubblicato sullo stesso fascicolo (Progression of early features of spinocerebellar ataxia type 2 in individuals at risk: a longitudinal study. Pg. 482.) di 40 pz a rischio di Atassia Spinocerebellare (SCA2)(MIM #183090), malattia da espansione di una tripletta CAG nella regione codificante di ATXN2, la seconda atassia come frequenza. Lo studio ha riguardato 21 pz con la mutazione seguiti per 6-27 anni (mx di 7 controlli longitudinali) e 19 controlli figli senza mutazione di pz con mutazione del gene nel periodo 1986-2013 a Cuba dove, per effetto del fondatore, la malattia ha una frequenza particolarmente alta. Due dei 21 portatori non ha sviluppato segni nel corso entro il termine dello studio. L’81% dei portatori ha avuto crampi dai 4 ai 12 anni prima dell’atassia e l’81% ha avuto anomalie sensoriali comparse però successivamente (da 1 a 8 anni prima dell’atassia), tandem gait anomalo 1-2 anni prima. Come per tutte le malattie neurodegenerative la sperimentazione clinica va applicata prima del danno neurologico che è irreversibile. Il commento termina così: “Future studies will need to define the ideal time for early intervention and, more importantly, to identify new potential therapeutic approaches”.

Distinct neurological disorders with ATP1A3 mutations. Lancet Neurology 2014;13:503. Eterogenità allelica con fenotipi diversi per il gene ATP1A3 che codifica la subunità α3 della pompa sodio-potassio (Na+/K+-ATPasi) e in cui mutazioni diverse (con una sola eccezione) causano due diverse malattie, la Distonia Parchinsonismo ad esordio rapido (RDP)(MIM #128235) e l’Emiplegia alternante 2 (AHC)(MIM #614820). Anche se parzialmente si incominciano a capire le conseguenze funzionali delle mutazioni di questo gene con il ricorso a modelli in vitro e negli animali di laboratorio. Poco ancora è conosciuto sul perché mutazioni diverse causino i due diversi fenotipi. Mentre le mutazioni che causano RDP sono diffuse, quelle causa di AHC sono concentrate in specifiche aree della proteina.

De novo CCND2 mutations leading to stabilization of cyclin D2 cause megalencephaly-polymicrogyria-polydactyly-hydrocephalus syndrome. Nature Genetics 2014;46:510. Mutazioni germinali di PIK3R2 e di AKT3 sono causa della sindrome Megalencefalia-polimicrogiria-polidattilia-idrocefalia (MPPH)(MIM #603387), mentre mutazioni postzigotiche di PIK3CA sono causa della sindrome Megalencefalia-malformazione dei capillari (MCAP)(MIM #602501) e mutazioni postzigotiche di PIK3R2 e di ATK3 della emimegalencefalia isolata. Ma nel 35% dei casi di MPPH non è presente una mutazione germinale di PIK3R2 o di AKT3. Da qui l’idea di applicare WES: trovate in 12 soggetti mutazioni missenso, in 8 sicuramente de novo, del gene CCND2 che codifica la ciclina D2, con un hotspot in un residuo che può essere fosforilato dalla glicogeno sintasi chinasi 3β, la cui attività è modulata dal pathway PI3K-AKT. Studi in vitro e in vivo (encefalo embrionale di topo) dimostrano che vi è un meccanismo patogenetico comune in tutte queste sindromi megalencefaliche che è dovuto alla patologica stabilizzazione della ciclina D2, causata da mutazione di CCND2 o da attivazione di PI3K-AKT.

An Atlas of Expression. Nature 2014;509:645. Technology Feature, che ha come sottotitolo: The first draft of the complete human proteome has been more than a decade in the making. In the process, the effort has also delivered lessons about technology and biology. Nel 2003, due anni dopo la pubblicazione dei risultati del Progetto Genoma Umano un gruppo svedese ha lanciato l’Human Protein Atlas (HPA)  per mappare in quali tessuti e cellule sono espresse le proteine codificate. Questo progetto include anche lo studio della funzione proteica con l’identificazione delle proteine di membrana che importano o esportano molecole dalle cellule del “secretoma” (proteine secrete dalle cellule) in condizioni fisiologiche o patologiche, informazioni utili anche per la farmacologia. Questo catalogo del proteoma umano, che sarà disponibile il prossimo Novembre, è stato possibile grazie al contributo volontario di donatori di tessuti durante trattamenti di varie malattie, contiene molte soprese come il fatto che 3.500 geni codificano proteine specifiche di uno o di pochi tessuti e che un terzo di queste proteine sono presenti nel testicolo, più di ogni altro organo.

Ma ci vorranno almeno altri 5 anni per avere dati certi.

Non è l’unico catalogo del proteoma umano, infatti c’è l’Human Proteome Project, che usa strategie differenti e poi ci sono progetti di altri gruppi di ricerca. Due bozze sono riportate in due articoli sullo stesso fascicolo (A draft map of the human proteome. Pg. 575)(http://www.humanproteomemap.org) e Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Pg. 582.

Noninvasive in vivo monitoring of tissue-specific global gene expression in humans. PNAS 2014;111:

7361. Lo studio di RNA libero circolante nel sangue potrebbe dirci molto nello stati di salute e nella malattia. E’ stato studiato l’RNA con microarray e next-generation sequencing di 4 adulti e di 11 gravide in vari periodi della gravidanza e nel postpartum. In gravidanza è stato possibile monitorare l’espressione genica nel tempo e tessuto specifica del feto, con livelli che crescono con il procedere della gravidanza per poi cadere rapidamente dopo il parto. L’RNA libero potrebbe essere in futuro un metodo di controllo dello stato di salute materno e fetale in gravidanza.

Lo stessa metodologia è stata applicata a 6 pz con Alzheimer in cui sono stati trovati elevati livelli di trascritto della proteina precursore amiloide. Va verificata la sensibilità e la specificità di questo promettente biomarker.

MDA5 and autoimmune disease. Nature Genetics 2014;46:418. Commento dell’articolo (Gain-of-function mutations in IFIH1 cause a spectrum of human disease phenotypes associated with upregulated type I interferon signaling. Pg. 503) in cui si documenta che mutazioni con acquisizione di funzione del gene IFIH1, che codifica il sensore RNA citosolico MFA5, determinano risposte eccessive di interferone tipo 1 aumentate causando fenotipi autoimmunitari, tra cui la sindrome Aicardi-Goutières e il lupus sistemico eritematoso (vedi per l’Aicardi Articoli di interesse Dicembre 2013, malattia neurologica grave a inizio nei primi mesi di vita con distonia, calcificazione dei gangli basali, microcefalia postnatale e rapida progressione con decesso in età infantile: Assessment of interferon-related biomarkers in Aicardi-Goutières syndrome associated with mutations in TREX1, RNASEH2A, RNASEH2B, RNASEH2C, SAMHD1, and ADAR: a case-control study. Lancet Neurology 2013;12:1159)(mutazioni malattia di TREX1, OMIM #225750, sono con perdita di funzione).

Due articoli sul melanoma familiare sullo stesso fascicolo di Nat Genet: POT1 loss-of-function variants predispose to familial melanoma. Nature Genetics 2014;46:478 e Rare missense variants in POT1 predispose to familial cutaneous malignant melanoma. Pg. 482. Nel 10% dei casi di melanoma cutaneo, che è la principale causa di morte tra tutti i tumori cutanei, vi è un parente di primo grado con la stessa patologia e nell’1% ve ne sono due o più parenti di primo grado affetti. In circa il 50% dei casi familiari sono stati individuati alcuni geni predisponenti, il più frequente è CDKN2A (40%), CDK4 e TERT.

Nel primo lavoro sono stati studiati con WES (168 casi) o WGS (16 casi) 105 famiglie con più membri affetti o sporadici con melanomi primari multipli o molto precoci (UK, Olanda, Australia), negativi all’analisi di CDKN2A e di CDK4. Nel 4% dei casi familiari e nel 5.8% delle famiglie con ≥5 affetti è stata trovata una mutazione germinale con perdita di funzione del gene POT1, che è quindi come frequenza il secondo gene mutato e con alta penetranza coinvolto nel melanoma familiare. Varianti del gene POT1 (protection of telomeres 1) predispongono alla formazione del melanoma tramite un effetto diretto sui telomeri.

Nel secondo lavoro sono stati studiati con WES 101 casi di melanoma cutaneo di 56 famiglie con più affetti provenienti dall’Emilia Romagna. E’ stata trovata una mutazione missenso ritenuta causa della malattia in 4 famiglie con una modalità di trasmissione AD, con lo stesso aplotipo che contiene la variante condiviso tra tutti i portatori facendo pensare ad un antenato comune (9.5 generazioni con DS 3.9). Questa stessa variante, cercata in un’ampia popolazione di pz italiani (1.824 pz), è stata trovata in un solo caso sporadico.

Altre due varianti di POT1, ritenute causa di malattia, sono state trovate sempre nelle famiglie italiane. L’analisi esomica e mirata di POT1 è stata poi estesa ad altre popolazioni (USA, Francia e alcune anche dalla Spagna) e sono state trovate mutazioni germinali missenso anche ricorrenti. In sintesi quindi è stato individuato un nuovo e frequente gene di suscettibilità del melanoma, sottolineando il ruolo dei geni coinvolti nel mantenimento dei telomeri, come POT1 e TERT (telomer­ase reverse transcriptase) nel controllo dello sviluppo del melanoma.

A catalogue of human gene activity. Nature Reviews Genetics 15, May 2014. Commento di due articoli sui progressi dell’annotazione funzionale (identificazione di geni e altri elementi funzionali) e del catalogo dell’attività di promotori e di enhancer (intensificatori) del genoma umano (The FANTOM Consortium and the RIKEN PMI and CLST (DGT). A promoter-level mammalian expression atlas. Nature 2014;507:462. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature 2014;507:455).

The Biology and Genetics of Obesity — A Century of Inquiries. NEJM 2014;370:1874. Perspective di storia della medicina sulla genetica dell’obesità e articolo sullo stesso fascicolo (A Form of the Metabolic Syndrome Associated with Mutations in DYRK1B. Pg. 1909) con risultati di un’analisi di linkage e dell’esoma in 3 famiglie con più affetti da malattia coronarica precoce, obesità centrale, ipertensione e diabete m. Identificata mutazione missenso, con funzione attivante, del fondatore nel dominio chinasico altamente conservato del gene DYRK1B che cosegrega con la malattia. La proteina di questo gene inibisce i segnali SHH e Wnt e potenzia l’adipogenesi e promuove l’espressione dell’enzima chiave neoglucogenico Glucosio-6-fosfatasi.

In una popolazione di 800 pz con grave obesità non correlati è stata trovata un’altra mutazione dello stesso gene in 5, una missenso attivante che in una famiglia segrega in modo AD. Tale mutazione funzionalmente aumenta l’espressione di Glucosio-6-fosfatasi.

Il gene DYRK1B fa parte quindi di un importante pathway che, quando alterato, causa la sindrome metabolica.

Genetic variants of Adam17 differentially regulate TGFβ signaling to modify vascular pathology in mice and humans. PNAS 2014;111:7723. Il pathway di segnale TGFβ è il target terapeutico di molte malattie come cancro e la fibrosi, ma questo pathway è essenziale per il mantenimento del sistema vascolare come lo dimostrano i fenotipi vascolari del topo e malattie dell’uomo come la teleangectasia ereditaria (HHT) da mutazione con perdita di funzione di geni del pathway TGFβ (BMP, ENG, ALK1, SMAD4). Pz con HHT hanno malformazioni vascolari multiorgano, iniziando con epistassi e proseguendo con teleangectasie multiple cutanee e mucose che causano emorragie croniche e anemia refrattaria al trattamento. Ma alcuni pz hanno gravi malformazioni artero-venose in vari organi, incluso il SNC, polmone (30-50% dei pz) e fegato che possono comportare gravi complicazioni.

In questo lavoro viene identificato nel topo un locus modificatore Adam17 (disintegrina e metalloproteasi 17) di TGFβ. Esiste questo effetto modificatore anche nella HHT? Si dimostra che nei pz con HHT alcuni polimorfismi di ADAM17 si associano con la presenza di malformazione artero-venosa polmonare nella HHT1 (da mutazione ENG) ma non nella HHT2 (da mutazione ALK1), indicando quindi che questi polimorfismi possono potenziare la malattia vascolare dipendente da TGFβ. Con la limitazione della significatività statistica per i piccoli numeri di pz di una malattia così rara, i dati suggeriscono che l’interazione tra varianti ADAM17 ed il pathway di segnale TGFβ influenzino nell’uomo la gravità della patologia vascolare.

Fragile X Mental Retardation Protein FMRP in the DNA Damage Response. Cell 2014;157:869. La proteina FMRP è presente principalmente nel citoplasma dove regola la traduzione delle proteine coinvolte nella funzione sinaptica. Nel lavoro si dimostra che svolge anche una funzione legante la cromatina e nel nucleo regola la risposta al danno del DNA durante la spermatogenesi del topo. Quindi FMRP a livello nucleare regola la stabilità genomica e può influire sulla gametogenesi e su alcuni aspetti della sindrome Fragile X (macroorchidismo? Anomala risposta al danno del DNA con danno neuronale?).

Defective Mitophagy in XPA via PARP-1 Hyperactivation and NAD+/SIRT1 Reduction. Cell 2014;157:882. In molte malattie neurodegenerative o legate all’età è documentabile una disfunzione mitocondriale.  Nel lavoro si dimostra che nello Xeroderma Pigmentoso A (XPA)(MIM #278700) un’anomala mitofagia (clearance autofagica di mitocondri danneggiati) è un meccanismo base di questa malattia da difettosa riparazione del DNA, causata da iperattivazione di PARP1 e riduzione del segnale NAD+-SIRT1-PGC-1α. Questo meccanismo patogenetico di anomalia mitofagia è in comune con altre malattie della riparazione del DNA con neurodegenerazione (Atassia Teleangectasia- MIM #208900, e s. Cockayne – MIM #216400), ma non nello XP tipo C (MIM #278720) che non ha la neurodegenerazione.

FERTILITA’/FECONDAZIONE ARTIFICIALE/DIAGNOSI PRENATALE

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Noninvasive prenatal diagnosis of common aneuploidies by semiconductor sequencing. PNAS 2014;111:7415. Primi risultati di un’altra tecnica (semiconductor sequencing platform)(SSP) per la diagnosi prenatale non invasiva utilizzando DNA fetale libero nel plasma materno. La tecnica adottata riduce i tempi e i costi rispetto alle tecniche sinora adottate mantenendo un’analoga sensibilità e specificità per le comuni aneuploidie.

Mitochondrial manipulations. Nature Medicine 2014;20:451. Editoriale sulla donazione dei mitocondri con la tecnica nota come Three-parent baby (o embryo)(vedi vari articoli. Lettere, commenti segnalati in varie Spigolature, l’ultima del Febbraio 2014) con la sostituzione dei mitocondri di un oocita che portano una mutazione con quelli di una donatrice consentendo comunque la trasmissione del solo DNA nucleare dei genitori. Tecnica che consente di prevenire nei prodotti del concepimento a rischio di ereditare mutazioni mtDNA la malattia mitocondriale, ma che pone tuttora riserve sia scientifiche che etiche che non ne consentono per ora un’applicazione clinica.

Ma..

The power of three. Nature 2014:509:414. Techniques that transfer DNA from diseased human eggs to healthy ones — creating offspring with three biological parents — are on the verge (sul punto di) of clinical use. Tecnica che sta per essere approvata dal Parlamento inglese, tecnica che inizia la sua storia negli anni ’80 con il trasferimento nel topo del pronucleo di un oocita fecondato in un altro oocita lasciando il resto in sede. In questo articolo si fa la storia di questa tecnica che si è voluto applicare all’uomo, molto contestata, con il primo esperimento nel 2010. Da allora la tecnica è stata modificata (in realtà vi sono due diverse modalità: trasferimento del pronucleo e il trasferimento del fuso materno) e sta per essere approvata dal Parlamento UK.

Lack of testicular seipin causes teratozoospermia syndrome in men. PNAS 2014;111:7054. E’ nota una relazione tra funzione del tessuto adiposo e fertilità maschile, con obesità associata a infertilità maschile. Non è noto se la situazione contraria, cioè la lipodistrofia, abbia un effetto sulla fertilità maschile, anche da una metanalisi risulta che il sottopeso è associato ad un “increased but nonsignificant risk” di oligospermia (vedetevi la gustosa nota statistica sulla “trappola del quasi significativo” nella selezione Aprile 2014: Trap of trends to statistical significance: likelihood of near significant P value becoming more significant with extra data. BMJ 2014;348:g2215). La Lipodistrofia congenita Berardinelli–Seip (BSCL) è geneticamente eterogenea, la tipo 2 (MIM #269700) è dovuta a mutazione del gene BSCL2 che codifica una proteina transmembrana a funzione non nota, la seipina, localizzata a livello del reticolo endoplasmatico di adipociti e altre cellule e che è molto espressa nell’encefalo, testicolo e tessuto adiposo. La sua carenza nel SNC causa la Paraplegia spastica 17 (s. Silver)(MIM #270685). Non si conosce il suo ruolo a livello testicolare.

E’ stato studiato un maschio con lipodistrofia familiare e una sorella affetta, ambedue composti eterozigoti di una mutazione farmeshift e una nonsenso del gene BSCL2. Il fenotipo del maschio è di assenza di grasso sottocutaneo con aspetto acromegalico, ernia ombelicale e acantosi nigricans alle ascelle, grosso pene e volume testicolare aumentato con teratoazoospermia con anomalie morfologiche degli spermatozoi.

Analogo aspetto degli spermatociti nel topo nullo per Seipina con grosse gocce lipidiche ectopiche e aggregati di spermatociti non funzionali. Il mutante murino condizionale nel tessuto adiposo ha lipodistrofia ma è fertile, mentre la perdita di seipina nelle cellule germinali causa infertilità maschile con teratoazoospermia. Quindi non è il fenotipo lipodistrofia che causa infertilità maschile. Piuttosto il difetto di seipina causa anomalie della testa dello spermatozoo, accumulo di grosse gocce lipidiche e aggregazione di spermatozoi non funzionali.

TERAPIA

Gene-therapy reboot. Nature 2014;509:651. Sottotitolo: Safer, more efficient methods to deliver therapeutic genetic material are generating jobs for savvy scientists. Riavvio quindi della terapia genica iniziata nel 1990 basata principalmente sull’uso di virus (retrovirus, lentivirus e adeno-associated virus) che veicolano e inseriscono nel genoma di una persona il gene di interesse. Non solo per le malattie genetiche, come ad es. con Glybera (alipogene tipar­vovec) per la terapia del deficit di Lipoproteina lipasi in pz con grave pancreatite (approvata nel 2012 dall’EMA), o recentissimamente la coroideremia (Lancet 2014;383:1129), ma anche per malattie acquisite come la leucemia (linfocitica cronica e linfoblastica acuta) con ottimo successo. Secondo un concetto di tecnologia dell’informazione conosciuto come Gartner Hype Cycle. “Whenever there’s a new technology, it goes from a peak of inflated expectations, to a trough of disillusionment, to a slope of enlightenment, and a plateau of productivity”. Quindi ora “Gene therapy is in the enlightenment stage”.

MODELLI ANIMALI E PROPOSTE TERAPEUTICHE

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Prevention and reversal of severe mitochondrial cardiomyopathy by gene therapy in a mouse model of Friedreich’s ataxia. Nature Medicine 2014;20:542. L’accumulo di ferro nei tessuti ha un effetto tossico per la formazione di radicali liberi dell’ossigeno (specie reattive dell’ossigeno –ROS) con accumulo più pronunciato nei mitocondri con alta attività ossido-riduttiva. L’Atassia Friedreich (MIM #229300), in cui la mutazione più frequente è costituita dall’espansione trinucleotidica GAA nell’introne 1 del gene FXN (>70 contro 5-30 dei normali alleli), è considerata una malattia da alterata omeostasi del Fe nei mitocondri da carenza del prodotto genico (FXN) che causa un accumulo di Fe, stress ossidativo e neurodegenerazione, miocardiopatia ipertrofica e diabete. L’insufficienza cardiaca è la principale causa di morte. Non c’è terapia. Il modello murino condizionale con delezione della FXN nel muscolo cardiaco e scheletrico ricapitola bene quanto si osserva nell’uomo anche se il decorso è più rapido e grave. Nel lavoro si dimostra che il vettore adenovirus che esprime la FXN umana iniettato in vena previene l’insorgenza della patologia cardiaca. Se somministrato con l’insufficienza cardiaca già in atto è in grado di restituire in pochi gironi la normale funzionalità e a normalizzare la struttura miocardica a livello sia cellulare che molecolare.  Una “prova di concetto” per una potenziale terapia genica per la miocardiopatia ipertrofica della m. Friedreich.

Is animal research sufficiently evidence based to be a cornerstone of biomedical research? BMJ 2014;348:g3387. Sottotitolo:” Public acceptance of the use of animals in biomedical research is conditional on it producing benefits for humans”. Gli AA “argue that the benefits remain unproved and may divert funds from research that is more relevant to doctors and their patients”.  Già 10 anni fa, quando 2/3 dei finanziamenti pubblici e privati erano dedicati alla ricerca di base, gli AA facevano notare che mancavano dati certi di benefici per l’uomo della ricerca su animali non ero provati. Ora portano ulteriori dati su questa loro impressione criticando vari aspetti, anche metodologici, adottati usando gli animali, chiedendosi se sia etico e se i fondi siano ben usati. Suggeriscono di inserire nel processo di valutazione di ricerche cliniche con l’uso di animali personale “laico” (buona idea, basta però che non reclutino gli “animalisti integralisti”, ndr).

Still much to learn about mice, Nature 2014;509:399. Sottotitolo: A project that aims to mutate every gene in the mouse genome to improve our knowledge of mouse biology should help to avoid irreproducible results and costly failures in drug development. L’inizio di questo editoriale è bello anche perché sintetico: il topo è diventato il re della scienza di laboratorio e il suo genoma è stato il primo ad essere sequenziato dei mammiferi dopo quello dell’uomo. Da molti anni sono stati creati topi mutanti per capire come funzionano i geni, come i pathway molecolari operano sia nei sani che negli ammalati. Dal 2010 è stato creato un International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC) che ha la finalità di creare topi mutanti condizionali per ogni gene, in cui il gene di interesse può essere spento a comando, per verificare cosa succede a livello comportamentale, clinico, anatomico fisiologico quando il gene viene disattivato. Si stima che il costo di tale impresa sia di 900 milioni di US$ sostenuto dai vari partecipanti. I primi 1.000 mutanti saranno disponibili nei prossimi mesi, 15.000 entro il 2021.

Problemi (oltre ai finanziamenti, ndr): come sottolineato dal commento sotto riportato sulla Sclerosi Laterale Amiotrofica, non sempre un farmaco che funziona nel topo funziona anche nell’uomo. In più differenti laboratori usano differenti ceppi e quindi gli effetti della mutazione dello stesso gene o gli effetti di una terapia possono essere diversi, addirittura contrastanti. Quindi: it is so desirable to have repositories that guard the health and genetic quality of the deposited mice.

Make mouse studies work Nature 2014;509:423. Commento sulla frequente (80%) non corrispondenza tra potenzialità terapeutica nel topo e nell’uomo, dovuta, almeno in parte a inadeguati esperimenti preclinici, con costi umani (patients with progressive terminal illnesses may have just one shot) e costi economici di centinaia di milioni di dollari. Facciamo l’esempio della Sclerosi Laterale Amiotrofica: una dozzina di trattamenti sperimentali efficaci negli animali senza alcun effetto nell’uomo (efficace tabella di 9 di questi).

Per rendere gli esperimenti preclinici efficaci l’ALS Therapy Development Insti­tute (TDI) ha preparato ninee guida nella selezione degli animali e degli obiettivi, che dovrebbero riguardare tutte le speriementazioni precliniche, non solo quelle per ASL, tra cui “know your animals”, “cancel the noise” come “Exclude irrelevant animals, Balance for gender, Split littermates among experimental groups, Track genes” e poi altre, ade s. per malattie neurodegenerative con effetto in età adulta e in cui si valuta la sopravvivenza calcolare bene la numerosità del campione utilizzando modelli matematici, le dosi del farmaco (possibilmente sperimentazioni con dosi diverse) e, per ridurre i rilevanti costi sostenuti dai singoli laboratori condividere i nuovi modelli animali.

Mutation of mouse Samd4 causes leanness, myopathy, uncoupled mitochondrial respiration, and dysregulated mTORC1 signaling. PNAS 2013;111:7367. Nel corso di uno studio di mutagenesi germinale murina è stato individuate un topo con un fenotipo “magro” con miopatia, alta spesa energetica nonostante una ridotta attività fisica e ridotta tolleranza glucidica, fenotipo (chiamato “supermodello”)(top model? Ndr) da mutazione recessiva missenso di un gene (Sterile alpha motif domain containing protein 4)(Samd4), che codifica una proteina legante l’RNA a funzione non ben nota nei mammiferi. Nel lavoro si dimostra che Samd4, insieme a mTORC1, svolge in vivo un ruolo importante nella regolazione del metabolismo.

Needed: More Females in Animal and Cell Studies. Science 2014;344:679. Già 20 anni fa NIH aveva denunciato negli studi sull’uomo un sex bias verso il sesso maschile che doveva essere corretto. Nella nota odierna si sottolinea che questa parità di sesso deve valere per gli studi che usano animali o cellule perché “Sex really has to be considered as a fundamental variable  when designing experiments”. Infatti ora NIH chiederà che quando si fa un progetto di ricerca sia bilanciato il sesso, che si tratti di animali o di cellule, o che venga spiegato perché no. E “when NIH speaks, people listen” (avessimo anche noi un NIH, o con il 40.8% ce l’abbiamo già? Ndr).

TERAPIA GENICA/CELLULE STAMINALI

CRISPR technology for gene therapy. Nature Medicine 2014;20:476. Community Corner relative ad un articolo (Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nature Biotechnology published online, 31 March 2014 doi:10.1038/nbt.2884) sulla potenziale utilità di ricorrere a un sistema di genome-editing come strategia terapeutica in vivo. Ha funzionato nel modello murino di tirosinemia ricorrendo alla tecnologia genome editing CRISP-Cas9 con RNA disegnato che guida la nucleasi Cas9 al bersaglio voluto di DNA (vedi Articoli di interesse Aprile 2014 Genome editing for all. Nature Biotechnology 2014;32:295). Nel topo con iniezione idrodinamica è stato ricostruito il gene Fah (fumaril aceto-acetasi) normale.

I pareri sono per un tenue ottimismo: “Development of delivery alternatives is essential for therapeutic application and is already under way”. “A good first proof-of-principle experiment”. “Arguably, the system would need to become at least tenfold more efficient to have therapeutic potential in even the most permissive settings”.

Vedi anche Perspective Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution. Science 2014;344:707. Uncovering how an RNA-protein molecular scalpel targets DNA will advance our ability to engineer genomes.

MALATTIE COMPLESSE/STUDI ASSOCIAZIONE

Severe osteoarthritis of the hand associates with common variants within the ALDH1A2 gene and with rare variants at 1p31. Nature Genetics 2014;46:498. L’osteoartrite è una frequentissima patologia dell’intera articolazione che determina distruzione e riparazione dei tessuti articolari e interessa, quella delle mani, il 16% della popolazione femminile e l’8% della maschile. L’analisi GWAS nella popolazione islandese e poi olandese e UK ha permesso di identificare due loci significativamente associati: uno nel gene ALDH1A2 e una variante in 1p31. Quest’ultima segrega in una famiglia con vari membri affetti.

Statistical power and significance testing in large-scale genetic studies. Nature Reviews Genetics 2014;15:335. Review dei principi e delle applicazioni dei test di significatività e del potere di calcolo statistico che riguarda anche le analisi di varianti genetiche rare.